B7-H3在結直腸癌中的研究進展

金玉芬，張婷，姜新，章立華，茆勇#

1江南大學無錫醫學院腫瘤免疫與耐藥實驗室，江蘇 無錫 277100

2江南大學附屬醫院腫瘤科，江蘇 無錫 277100

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的惡性腫瘤，也是導致惡性腫瘤相關死亡的第三大原因，對患者的生活質量和生命健康造成嚴重影響[1-2]。美國的一項調查結果顯示，CRC是一種典型的老年疾病，但是，自20世紀90年代中期以來，55歲以下CRC患者的病死率每年增長約2%[3]。雖然，近年來，對CRC生物學的理解以及治療策略的改進方面有了實質性的進展，但由于早期CRC缺乏典型臨床癥狀，大多數患者被診斷時已處于晚期，因此，尋找新的分子標志物并完善已有的治療手段是必要的[4-5]。CRC的發生呈現出從正常組織經過息肉、腺瘤、高級別瘤變等病變緩慢發展至惡性腫瘤的漫長過程，免疫細胞的浸潤、免疫因子的產生及其與腫瘤細胞的相互作用在微環境中發揮了極其重要的作用[6-7]。已有研究證明，B7是一類主要表達于細胞質膜的免疫檢查點蛋白，可與T細胞、自然殺傷（natural killer，NK）細胞的受體分子相互作用，介導免疫的共刺激或共抑制信號[7-8]。共刺激分子B7-H3是B7-CD28家族的免疫檢查點分子之一。研究發現，B7-H3在正常組織和細胞中不表達或呈極低表達，但在多種惡性腫瘤組織中異常表達，并與患者的預后密切相關[9]。隨著研究的深入，越來越多的研究顯示B7-H3參與腫瘤的增殖、轉移、耐藥、代謝、血管新生、抗凋亡等非免疫過程[10-13]。因此，B7-H3可能是CRC的潛在標志物和治療靶點。本文就B7-H3的結構、功能及其在CRC中的表達情況及臨床意義的研究進展進行綜述。

1 B7-H3的結構、分布和受體

B7-H3是在人類樹突狀細胞的互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）文庫中被發現的B7家族的新成員，其在氨基酸序列上與B7家族其他成員的胞外域受體結合區有20%～27%的同源性，且結構相似，因此，被命名為B7 Homolog 3（B7-H3）[14]。成熟的B7-H3分子是一個編碼316個氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，包含N端的一個信號肽、一個存在細胞外的免疫球蛋白樣可變區（immunoglobulin V，IgV）和免疫球蛋白樣恒定區（immunoglobulin C，IgC）、一個跨膜區和一個含有45個氨基酸的胞內區[15]。特別的是，人體中的B7-H3主要存在2種形式的剪切體：胞外區由IgV-IgC 組成的 B7-H3a（2Ig-B7-H3）和胞外區由IgV-IgC-IgV-IgC組成的B7-H3b（4Ig-B7-H3）。小鼠的B7-H3分子僅有2Ig-B7-H3結構域，而人類以4Ig-B7-H3亞型表達為主[16]。此外，人體中的B7-H3除了表達于細胞膜上，還以可溶性形式存在。可溶性B7-H3分子主要存在于正常人的外周血中，可能參與多種生物學功能的發揮，但具體的調控機制及臨床意義尚有待探討[17]。

B7-H3mRNA廣泛表達于人類的免疫及非免疫組織器官，包括脾、胸腺、心臟、肝、前列腺、胎盤、睪丸、胰腺、小腸和大腸等；另外，B7-H3mRNA在正常組織和細胞中的表達水平較低，但在多種腫瘤組織和腫瘤細胞株中的表達水平較高。相較于B7-H3mRNA的廣泛表達，B7-H3在蛋白水平僅表達于少數正常組織，如人體的前列腺、乳房、肝、肺、膀胱、胎盤等；其在轉錄水平和蛋白水平的表達差異可能與轉錄后調控有關，但具體的轉錄后調控機制目前仍不明確[18-19]，推測機體內可能存在某種機制抑制了B7-H3在機體正常組織中的表達，而B7-H3的異常表達可能是腫瘤免疫的機制之一。

目前，由于B7-H3的受體及下游信號傳導通路尚未明確，因此，其在T細胞介導的免疫應答中的作用機制一直存在爭議。King等[20]認為TLT-2是B7-H3的受體，是髓細胞表達的觸發受體家族成員之一，其蛋白表達于CD8+T細胞，且可以被活化的CD4+T細胞所誘導。Hashiguchi等[21]通過生物信息學的方法發現TLT-2與CD28家族的基因序列有較高的同源性，后經實驗發現，鼠類B7-H3可與CD8+T細胞的TLT-2結合，促進T細胞的增殖、細胞因子的生成及細胞毒作用的發揮。然而，此結論隨后被Leitner等[22]否定，其采用流式細胞分析技術詳細分析了人B7-H3與TLT-2之間的相互作用，發現兩者未存在特異性結合的現象，因此，認為TLT-2并非B7-H3分子相對應的受體。

2 B7-H3在CRC 中的免疫調節功能

T淋巴細胞介導的免疫應答反應在機體感染和腫瘤免疫中發揮著至關重要的作用，根據功能的不同，共刺激分子主要分為兩類：正性共刺激信號，可維持T細胞的活化狀態，增強T細胞免疫應答反應；負性共抑制信號，可介導T細胞免疫耐受的形成，在腫瘤免疫逃逸中發揮作用[23]。早期研究認為，B7-H3共同刺激CD4+T和CD8+T細胞群的增殖，增強細胞毒性T細胞的誘導，并且選擇性地刺激γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的產生[14]。Loos等[24]收集了68例胰腺癌患者的石蠟組織標本和臨床資料，發現B7-H3的表達與腫瘤浸潤CD8+T細胞有關，且存在B7-H3mRNA表達的患者的術后生存期更長。Lupu等[25]建立了結腸癌小鼠模型，結果顯示，與不表達B7-H3的對照組相比，高表達B7-H3的小鼠的腫瘤體積縮小，IFN-γ、白細胞介素（interleukin，IL）-12水平均明顯升高。

隨著研究的深入，學者們有了不同的發現。Chen等[26]發現在移植肺癌模型中，腫瘤細胞中B7-H3的表達量隨著腫瘤轉化時間的延長而增加；另外，腫瘤相關巨噬細胞釋放的IL-10可以刺激腫瘤細胞膜上B7-H3的表達，抑制T細胞的免疫反應。同樣，Prasad等[27]發現小鼠B7-H3蛋白抑制T細胞活化和細胞因子的產生。此外，Ling等[28]證實B7-H3能夠抑制T細胞的體外增殖。Sun等[29]也證實B7-H3在胃癌中的高表達可以抑制機體對腫瘤的免疫監視功能。更有研究發現，B7-H3在非小細胞肺癌中的表達水平與CD133水平呈負相關[30]。研究顯示，B7-H3的表達與CRC組織中巨噬細胞的浸潤密度呈正相關，并與患者的總生存率呈負相關，提示了B7-H3信號對巨噬細胞的直接作用；進一步研究發現，在腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）分化過程中，B7-H3促進了M2型巨噬細胞的極化，使M1表型向M2表型轉變。因此，通過B7-H3途徑靶向調控TAM可能對開發針對人類CRC的新型免疫治療策略具有重要價值[31]。上述結果提示高表達的B7-H3能夠負性調節腫瘤免疫應答。

3 B7-H3在CRC 中的非免疫學功能

3.1 高表達的B7-H3促進腫瘤細胞的侵襲和轉移

侵襲和轉移是惡性腫瘤主要的生物學特征，二者既有聯系，又有區別。腫瘤侵襲是指腫瘤細胞脫離原發部位，侵襲穿越基底膜并向周圍間質浸潤性生長，是腫瘤細胞、周圍間質相互作用的結果，也是腫瘤擴散的第一步。腫瘤轉移是惡性腫瘤細胞從原發部位（原發腫瘤）穿越局部毛細血管或淋巴管進入血管或體腔，隨著血液運輸至靶組織或靶器官，在繼發部位不斷生長、增殖，形成與原發腫瘤不連續而組織學類型相同的腫瘤（繼發腫瘤）。腫瘤侵襲是腫瘤轉移的前提和基礎，而惡性腫瘤的轉移往往是腫瘤治療失敗的主要原因[32-33]。因此，了解惡性腫瘤侵襲和轉移的分子機制對遏制腫瘤的發展至關重要。

B7-H3可以影響腫瘤細胞的黏附、遷移、侵襲和轉移。研究表明，B7-H3過表達后通過調控人膀胱癌磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信號通路能夠促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[34]。Kang等[35]發現B7-H3可以誘導上皮-間充質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），并且通過Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/STAT3信號通路調控腫瘤細胞的轉移。另一項研究表明B7-H3可以靶向侵襲、轉移CXC趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4），并通過磷酸化JAK2、STAT3、AKT、胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）通路促進胃癌細胞的侵襲和轉移[13]。Liu等[36]發現B7-H3的過表達提高了CRC中基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的表達水平；另外，JAK2/STAT3通路在CRC的發病機制中發揮重要作用，抑制JAK2/STAT3信號通路可誘導CRC細胞的凋亡、阻滯，減少CRC細胞的侵襲；B7-H3通過激活JAK2/STAT3信號通路導致MMP9的表達上調，促進了CRC細胞的增殖和侵襲；此外，利用JAK2的特異性抑制劑AG490抑制JAK2/STAT3信號通路可明顯下調MMP9的表達。這些結果表明，MMP9是B7-H3/JAK2/STAT3信號通路的下游靶點，B7-H3可能通過JAK2/STAT3/MMP9信號通路促進CRC的侵襲。此外，Jiang等[37]發現B7-H3與CRC組織中MMP2、MMP9的表達呈正相關；體外實驗結果顯示，與對照組相比，在SW480細胞中過表達的B7-H3更容易使腫瘤細胞發生侵襲和轉移，而B7-H3在Caco-2細胞中被敲除后，腫瘤細胞的侵襲和轉移能力下降，并且在過表達B7-H3的SW480-B7-H3穩轉細胞株中，B7-H3可以下調E-cadherin和上調N-cadherin、CD133、CD44、Oct4的表達，提示共刺激分子B7-H3能夠促進CRC的EMT。

3.2 高表達的B7-H3促進腫瘤血管生成

血管生成參與多種生理、病理進程，如胚胎發育、傷口愈合、炎性反應等，也是腫瘤的生物學特性之一[38-39]，新生血管的生長和成熟是一個復雜的過程，由多種促血管生長因子和血管生成抑制因子調節，其中，功能最強、特異性最高的是血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），其能夠促進內皮細胞的分裂、增殖及腫瘤新生血管的構建、遷移，增加血管通透性[40]。然而，B7-H3在調節CRC血管生成中的生物學功能卻甚少。

研究表明，B7-H3在腫瘤細胞和腫瘤血管中廣泛過表達[41]。Zang等[42]發現B7-H3表達于卵巢癌血管內皮細胞中，與卵巢癌的組織學分型、臨床分期、疾病復發及預后密切相關。另一項研究表明，B7-H3與VEGF在CRC血管內皮細胞中的表達呈正相關，在CRC的發生、發展過程中，共同參與腫瘤血管新生和抗腫瘤免疫反應[43]。有研究收集了125例CRC組織樣本及其鄰近正常組織標本，結果發現，B7-H3在CRC組織中的水平明顯升高，并與血小板內皮細胞黏附分子-1（platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又稱CD31）水平呈正相關；經過一系列體外實驗和體內試驗，發現B7-H3通過上調VEGFA的表達促進腫瘤血管生成，shB7-H3 CRC細胞的條件培養基明顯抑制了人臍靜脈內皮細胞的遷移、侵襲和成管，而過表達B7-H3的CRC細胞的條件培養基明顯促進了人臍靜脈內皮細胞的遷移、侵襲和成管。此外，重組VEGFA消除了shB7-H3 CRC細胞的條件培養基對HUVEC血管生成的抑制作用，而VEGFA-小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）則逆轉了B7-H3過表達CRC細胞的條件培養基對人臍靜脈內皮細胞血管生成的影響[11]。因此，B7-H3對腫瘤血管生成的作用為闡明CRC的發病機制、尋找治療靶點提供了新思路。

3.3 高表達的B7-H3促進腫瘤代謝

葡萄糖可以通過氧化磷酸化和糖酵解兩種代謝途徑為細胞提供能量，即使在氧氣充足的條件下，惡性腫瘤細胞也會將葡萄糖代謝為乳酸鹽，被稱為Warburg效應[39]，其代表著腫瘤細胞對葡萄糖利用方式由氧化磷酸化到糖酵解的轉變，這種代謝變化目前被認為是腫瘤的一大生物學特征。

Lim等[44]探索了B7-H3在腫瘤細胞代謝重編程中的作用，發現兩個細胞株在進行B7-H3基因敲除后，乳酸產量和葡萄糖的攝取均明顯降低，而B7-H3高表達可以正向調控低氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1），從而促進腫瘤的糖代謝。同樣，Nunes-Xavier等[45]發現，腫瘤細胞中B7-H3的高表達會提高細胞的存活率，促進糖酵解。異檸檬酸脫氫酶 1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）是TCA循環中的一種代謝酶，其反應產物參與脂質合成。Wu等[46]采用免疫化學方法分析了225例CRC患者標本中IDH1和B7-H3的表達水平，結果顯示，IDH1與B7-H3的表達密切相關；在細胞實驗中，蛋白質印跡法（Western blot）檢測結果顯示，在高表達B7-H3的SW480-B7-H3-EGFP細胞中，IDH1的表達水平升高；同樣，在Caco-2-shB7-H3中B7-H3表達的下調亦有助于降低IDH1水平，進一步證明B7-H3和IDH1存在相關性，最終提示B7-H3可以通過影響IDH1的表達來影響腫瘤的代謝功能，但具體的調控機制仍不明確。有研究建立了兩個穩定過表達B7-H3的CRC細胞株，與對照細胞相比，B7-H3過表達的HCT116和RKO細胞的葡萄糖消耗和乳酸產量均明顯增加，己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）蛋白的表達水平也均升高，而當HK2被siRNA下調時，B7-H3誘導的葡萄糖攝取增加和乳酸產生能力明顯減弱；該研究還發現B7-H3低表達降低了STAT3的活性，并明顯下調了HK2的表達。提示B7-H3可以通過STAT3信號通路調控CRC細胞中HK2的表達[47]。

3.4 高表達的B7-H3增強耐藥性和抗凋亡能力

近年來，盡管新治療方法的出現使CRC的治療取得了顯著進展，但CRC患者發生耐藥成為了臨床治療的重要障礙之一。

有研究發現，B7-H3與腫瘤惡性程度呈正相關，并與化療藥物的耐藥有關[48]。Shi等[47]在小鼠模型中證明了B7-H3/HK2通路能夠在體內誘導CRC患者發生耐藥。Zhang等[49]使用不同濃度藥物孵育CRC細胞系48小時，結果顯示，過表達B7-H3的細胞對奧沙利鉑的抗性指數比對照組高4倍左右。另一項研究表明，B7-H3與抗凋亡蛋白在CRC細胞系中的表達呈正相關，提示過表達B7-H3可能增加腫瘤細胞對凋亡的抵抗。為了研究化療引起的細胞凋亡的確切反應，有研究使用高濃度的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）（50 μg/ml）孵育了SW620-NC、SW620-B7-H3-EGFP細胞48小時，結果顯示，與SW620-NC相比，SW620-B7-H3-EGFP對5-FU的抗性更強，凋亡更少，提示B7-H3過表達通過減弱CRC細胞對藥物的敏感性抑制細胞的凋亡能力[50]。一項研究采用免疫組化法發現B7-H3和CDC25A具有明顯的相關性，且認為B7-H3可以通過STAT3信號通路促進CDC25A的表達，進而增強CRC細胞的耐藥性[51]。

4 小結與展望

CRC是一種常見的惡性腫瘤。近年來，隨著治療方法的發展，CRC患者的5年生存率顯著提高。然而，疾病的轉移和復發仍然是CRC臨床治療的難點。因此，了解CRC的分子發病機制、尋找治療CRC的新靶點成為迫切需要。共刺激分子B7-H3是B7-CD28家族的免疫檢查點分子，在CRC等多種實體腫瘤中過表達。早期研究驗證了B7-H3在腫瘤免疫調節功能方面的潛力，但由于B7-H3在T細胞上的受體尚未明確，因此，B7-H3的免疫功能尚存在爭議。本實驗室采用免疫組織化學技術檢測了樣本中B7-H3的表達，發現B7-H3在CRC組織中過表達，并與腫瘤浸潤深度、遠處轉移和分化程度顯著相關。值得注意的是，B7-H3高表達患者的OS明顯短于低表達患者[4]，提示B7-H3可能是一個有價值的預后生物標志物，也是一種有前途的實體瘤治療新靶點。因此，在未來還需要進一步探索與B7-H3相關的腫瘤信號通路，在臨床實驗中納入更多的樣本以確定B7-H3在CRC中的表達情況及預后意義。