心臟再生治療的最新進(jìn)展

韓月 ，朱莉 ，宋桂仙

近年來(lái)，隨著社會(huì)快速發(fā)展和人們物質(zhì)生活水平不斷提升，心肌梗死等心血管疾病已成為導(dǎo)致人類(lèi)因病死亡的重要原因。多數(shù)急性心肌梗死患者最終會(huì)進(jìn)展為進(jìn)行性心力衰竭，而由于成年人心肌細(xì)胞幾乎沒(méi)有再生能力、受損的心肌會(huì)被纖維化瘢痕組織所取代，因此急性心肌梗死等心血管疾病的治療只能集中于保護(hù)心臟并避免進(jìn)展為心力衰竭，如通過(guò)溶栓、心臟介入和旁路移植手術(shù)等血運(yùn)重建術(shù)改善心肌血液供應(yīng)、挽救受損的缺血心肌，或通過(guò)抑制心肌重塑藥物血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensin Ⅱ receptor antagonists，ARB）、重組人腦利鈉肽（recombinant human brain natriuretic peptide，rh-BNP）、左孟西坦等降低心力衰竭致死率等。目前，心臟移植是治療終末期心力衰竭的唯一方法，但心臟供體來(lái)源及其免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題使心臟移植難以廣泛應(yīng)用。為保護(hù)衰竭的心臟，近幾十年來(lái)眾多科學(xué)家專(zhuān)注于促進(jìn)心臟再生的方法，而心臟再生成為當(dāng)前心血管病學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，本文主要綜述了心臟再生治療的最新研究進(jìn)展、局限性和發(fā)展前景。

1 干細(xì)胞

干細(xì)胞移植是目前心臟再生領(lǐng)域最重要的治療方法，雖然近兩年關(guān)于干細(xì)胞的研究呈“噴井式”爆發(fā)，但也面臨著巨大爭(zhēng)議，近兩年干細(xì)胞在心臟再生領(lǐng)域的最新進(jìn)展及爭(zhēng)議如下。

1.1 胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC） ESC指從胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)獲得的多能干細(xì)胞，其除具有向外胚層、內(nèi)胚層及中胚層分化的能力外，還具有無(wú)限的自我更新能力［1］。ESC很容易擴(kuò)增并能在體外分化為心肌細(xì)胞，可為心臟移植提供數(shù)量充足的心肌細(xì)胞。2015年，人類(lèi)ESC首次在心臟病患者中使用，即在冠狀動(dòng)脈旁路移植（coronary artery bypass graft，CABG）術(shù)或左房室瓣手術(shù)時(shí)向晚期缺血性心肌病患者遞送人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESC），經(jīng)超聲心動(dòng)圖檢查證實(shí)患者心臟收縮功能明顯改善，且隨訪3個(gè)月患者左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）較基線提高10%，即從26%提高到36%［2］。在一項(xiàng)大型動(dòng)物模型中，心肌梗死獼猴移植了7.5億個(gè)冷凍保存的人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞（human embryonic stem cellderived cardiomyocytes，hESC-CMS），結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植hESCCMS 1個(gè)月后心肌梗死獼猴總體LVEF明顯提高，移植hESCCMS 3個(gè)月后LVEF提高更加明顯且心肌梗死面積明顯減小［3］。近期VADAKKE-MADATHIL等［4］通過(guò)動(dòng)物模型證實(shí)，來(lái)自胎盤(pán)的一種干細(xì)胞—Cdx2細(xì)胞可在體外分化為自發(fā)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞和血管細(xì)胞，且與傳統(tǒng)胚胎干細(xì)胞相比，Cdx2細(xì)胞似乎可避免免疫排斥。

不同于經(jīng)皮心臟注射、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)和心室內(nèi)導(dǎo)管等傳統(tǒng)細(xì)胞移植方法，目前移植hESC的最新方法是將細(xì)胞整合到纖維蛋白薄片后放置于心包內(nèi)，這種方法具有提高細(xì)胞存活率、減少細(xì)胞損傷、降低室性心律失常發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、提高患者存活率及改善患者心臟功能等優(yōu)勢(shì)，但hESC移植可能存在醫(yī)學(xué)倫理方面的問(wèn)題，且有致心律失常、患者存活率低等風(fēng)險(xiǎn)，因此hESC移植能否用于心臟再生治療尚需進(jìn)一步研究。

1.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，IPSCs） 小鼠和人成纖維細(xì)胞被轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Sox-2、Klf4、c-Myc重新編程到類(lèi)似ESC的多能狀態(tài)則稱(chēng)之為IPSCs［5］。IPSCs提供了一種新的基于細(xì)胞的心臟修復(fù)方法，使自體或異基因移植成為可能，并避免了與ESC相關(guān)的倫理問(wèn)題。ROJAS等［6］通過(guò)將高純度小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞（induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，IPSC-CMS）移植到結(jié)扎左前降支的心肌梗死小鼠心臟并觀察28 d發(fā)現(xiàn)，移植的IPSC-CMS不僅會(huì)在心肌內(nèi)形成成熟的移植物、表達(dá)心臟標(biāo)志物并顯示出肌節(jié)結(jié)構(gòu)、有效地分化為心肌細(xì)胞，還可明顯抑制心肌重塑并改善左心室功能。MA等［7］研究發(fā)現(xiàn)，電刺激可通過(guò)激活Ca2+/PKC/ERK途徑而介導(dǎo)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）分化為心肌細(xì)胞，且經(jīng)電刺激預(yù)處理的hiPSCs來(lái)源的心肌細(xì)胞不僅能有效改善心臟功能并減小心肌梗死范圍，還能與宿主心臟功能相融合。近年研究發(fā)現(xiàn)，IPSCs分泌的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVS）富含miRNAs和具有促血管生成和細(xì)胞保護(hù)特性的蛋白質(zhì)，可在體外增強(qiáng)小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞血管生成、遷移及抗凋亡特性，且與IPSCs相比，IPSCs分泌的EVS能更好地改善左心室功能、減少細(xì)胞凋亡、減少畸胎瘤的形成等［8］，而為IPSCs衍生的心肌細(xì)胞提供支架如羊膜、水凝膠、細(xì)胞片等則已被證實(shí)可提高心臟再生治療效果［9-11］。

雖然IPSCs已被證實(shí)為心臟再生治療領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破，但與其他干細(xì)胞一樣，IPSCs也存在著分化不成熟、存活率低、致心律失常、增加腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等缺陷，相信隨著IPSCs分泌的EVS的發(fā)現(xiàn)、IPSCs純度的提高、電刺激技術(shù)及新型支架的發(fā)明等，IPSCs的缺陷將被一一攻破，用于心臟再生治療的風(fēng)險(xiǎn)將進(jìn)一步降低。

1.3 內(nèi)源性心臟干細(xì)胞/祖細(xì)胞（endogenous cardiac stem cells/progenitor cells，CSCs/PCs） CSCs/PCs包括c-kit+細(xì)胞、Sca-1+細(xì)胞、心球樣細(xì)胞團(tuán)源性細(xì)胞（cardiosphere-derived cells，CDC）、islet-1+細(xì)胞及心外膜來(lái)源細(xì)胞［12］。早在2001年，哈佛大學(xué)著名科學(xué)家PIERO ANVERSA便稱(chēng)可以用骨髓來(lái)源的c-kit+細(xì)胞使心肌再生；2003年，PIERO ANVERSA在《細(xì)胞》雜志上發(fā)表文章稱(chēng)成人心臟中有一組具有在心臟損傷后分化為心肌細(xì)胞能力的c-kit+細(xì)胞，但從2004年起就不斷有質(zhì)疑的聲音出現(xiàn)：有學(xué)者發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的c-kit+細(xì)胞并不能分化為心肌細(xì)胞，因此其用于心臟再生治療已被否定；2014—2016年，有三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室通過(guò)體內(nèi)基因追蹤技術(shù)確認(rèn)成年人心臟中c-kit+細(xì)胞并不具有分化為心肌細(xì)胞的能力，即不是心臟干細(xì)胞［13-18］。

近期，PIERO ANVERSA的心臟干細(xì)胞學(xué)術(shù)造假新聞將干細(xì)胞研究推向了風(fēng)口浪尖，哈佛大學(xué)最終撤回了PIERO ANVERSA關(guān)于心臟干細(xì)胞的31篇研究性論文，結(jié)束了心臟干細(xì)胞療法這一騙局，而這一心臟干細(xì)胞學(xué)術(shù)造假的鬧劇除使全球數(shù)百萬(wàn)終末期心力衰竭患者的希望破滅外，還使全球?qū)τ诟杉?xì)胞在心臟再生治療中的作用心灰意冷并有人開(kāi)始全盤(pán)否認(rèn)干細(xì)胞研究領(lǐng)域的研究成果。在此需要指出的是，心臟干細(xì)胞研究與心臟的干細(xì)胞研究不同，心臟的干細(xì)胞研究領(lǐng)域十分廣闊，PIERO ANVERSA涉及的心臟干細(xì)胞研究只是其中之一，而我國(guó)關(guān)于干細(xì)胞的研究如間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、ESC、IPSCs等誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為心肌譜系細(xì)胞和干細(xì)胞旁分泌作用是無(wú)法磨滅的、有效可信的、前景巨大的。

2 多肽

多肽指α-氨基酸通過(guò)肽鍵連接在一起而形成的化合物，通常由三個(gè)或三個(gè)以上氨基酸分子脫水縮合而成，因此蛋白質(zhì)有時(shí)也被稱(chēng)為多肽［19］。目前，臨床上常見(jiàn)的多肽包括已被人們所熟知并具有一定診斷及治療價(jià)值的促紅細(xì)胞生成素、白介素、促甲狀腺激素釋放激素、腦鈉肽、利鈉肽等，而深入探索多肽在心臟再生治療中的作用則有助于為心臟再生治療開(kāi)辟出一條新的道路。

2.1 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）抑制劑 MMPs是一類(lèi)鋅依賴性內(nèi)肽酶，其主要參與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中各種蛋白質(zhì)的降解，而組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）是MMPs的特異性抑制劑，MMPs與TIMPs的失衡會(huì)破壞ECM的動(dòng)態(tài)平衡并導(dǎo)致心肌梗死、心臟損傷等［20］。PURCELL等［20］通過(guò)將組織金屬蛋白酶抑制劑3重組蛋白（recombinant tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-3，rTIMP-3）注射入心肌梗死豬模型并觀察28 d發(fā)現(xiàn)，心肌梗死豬左心室舒張末期容積、室壁變薄程度及左心房大小明顯減小，心肌梗死后不良重塑進(jìn)程中斷。FAN等［21］通過(guò)將基質(zhì)金屬蛋白酶2特異性抑制劑CTTHWGFTLC注入梗死的心臟發(fā)現(xiàn)，4周后心臟組織厚度增加并保留了與正常心臟組織相似的膠原成分，具有有效減少不良心肌重塑和改善心功能的潛力。AWADA等［22］通過(guò)組織金屬蛋白酶組織抑制劑3（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-3，TIMP-3）和其他兩種多肽堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-2）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α（stromal cell-derived factor-1 alpha，SDF-1α）處理心肌梗死大鼠發(fā)現(xiàn)，大鼠心臟收縮力有所改善，心臟擴(kuò)張程度明顯減輕，心臟炎癥、纖維化及ECM降解明顯減少。目前，MMPs抑制劑已成為心臟再生治療領(lǐng)域多肽研究方面最重要的部分。

2.2 1，4-二（4-苯氧基苯甲酰基）苯（P-EKKE） 近期，筆者所在課題組應(yīng)用Nano LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)篩選出一條與心臟再生相關(guān)的多肽p-EKKE，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，P-EKKE由12個(gè)氨基酸組成，分子量為2 kDa，等電位點(diǎn)為6.14，是一條疏水性多肽，在體內(nèi)比較穩(wěn)定；P-EKKE來(lái)自于前體蛋白半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白3（cysteine and enrichment of glycine protein 3，CSRP3），而CSRP3對(duì)細(xì)胞增殖、周期具有重要調(diào)控作用［23］，多肽常與前體蛋白功能相似；P-EKKE在哺乳動(dòng)物中高度保守，人、猿猴、大鼠、小鼠P-EKKE序列完全一致，提示P-EKKE具有重要的潛在功能，并因此而成為筆者所在課題組關(guān)注的目標(biāo)。筆者所在課題組通過(guò)將熒光標(biāo)記的P-EKKE經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，1 h后在小鼠心臟部位發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記的P-EKKE。H9c2細(xì)胞是源自心臟肌層的鼠源細(xì)胞系，可高度模擬在體心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，目前已被廣泛地用于心血管疾病的基礎(chǔ)與臨床研究［24］；筆者所在課題組采用熒光標(biāo)記的P-EKKE培養(yǎng)H9c2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，P-EKKE可有效促進(jìn)H9c2細(xì)胞增殖并促使細(xì)胞進(jìn)入S期及G2期，并能有效調(diào)節(jié)周期相關(guān)基因的表達(dá)，初步證實(shí)P-EKKE在心臟再生過(guò)程中發(fā)揮作用的可能性，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)關(guān)于P-EKKE在心臟再生治療中作用的研究報(bào)道，而對(duì)于P-EKKE在心臟再生過(guò)程中的作用及其作用機(jī)制等尚需進(jìn)行大量臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究，以為心臟再生治療提供新的思路。

3 中藥

中藥因?qū)Ω杉?xì)胞的誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用而在心臟再生領(lǐng)域中占得一席之地，有研究發(fā)現(xiàn)，中藥固本培元散的中藥合劑喂養(yǎng)的心肌梗死大鼠血清可在體外促進(jìn)新生大鼠心肌細(xì)胞和hiPSCs來(lái)源的心肌細(xì)胞的分裂，并促進(jìn)成年小鼠心肌損傷后心臟修復(fù)［25］；也有研究發(fā)現(xiàn)，中藥方劑柴胡龍骨髓湯可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymalstem cells，BMMSCs）動(dòng)員并抑制炎性反應(yīng)，減輕急性心肌梗死（AMI）引起的心臟損傷［26］。因此，中藥可能成為未來(lái)心肌損傷和心力衰竭的非侵入性替代治療的良好選擇。

4 microRNA（miRNA）

miRNA是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的約由22個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈RNA分子，其在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控［27］。近年研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞增殖受miRNA網(wǎng)絡(luò)控制［28］。BORDEN等［29］研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死小鼠經(jīng)miRNA-294治療兩個(gè)月后心臟功能明顯改善，受損心肌組織面積明顯減小且經(jīng)過(guò)處理的心臟細(xì)胞周期重新恢復(fù)，表明這些細(xì)胞被重新激活并恢復(fù)了產(chǎn)生新細(xì)胞的能力。GABISONIA等［28］研究發(fā)現(xiàn)，將一小段miRNA-199基因材料植入心肌梗死豬心臟一個(gè)月后其心功能幾乎完全恢復(fù)。由于miRNA持續(xù)和不受控制的表達(dá)將導(dǎo)致心律失常甚至死亡，因此，miRNA在心臟再生治療中的應(yīng)用目前還處于起步階段，且其劑量尚需嚴(yán)格控制。

5 3D打印心臟

心臟供體數(shù)量極其稀少，心臟移植供體不足和免疫排斥問(wèn)題是心臟移植的世界性難題，而近年來(lái)人造心臟的問(wèn)世將有利于解決這一世界性難題。早在2017年，香港中文大學(xué)的研究人員就成功利用干細(xì)胞打印出心臟組織；在2018年，香港大學(xué)的研究人員成功地利用干細(xì)胞和基因工程技術(shù)生產(chǎn)出世界上第一個(gè)迷你人造心臟；近期以色列科學(xué)家將提取的人體自身脂肪細(xì)胞重新編程為多能干細(xì)胞并將脂肪組織中ECM加工成“個(gè)性化水凝膠”，之后成功分化為心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，三者結(jié)合以充當(dāng)3D打印的“墨水”，最終世界首顆3D打印心臟問(wèn)世，這顆心臟不僅結(jié)構(gòu)完整而且具有收縮能力，但并不具有正常心臟搏動(dòng)及泵血功能，且一些細(xì)小的血管也無(wú)法打印出來(lái)［30］。3D打印心臟這一轟動(dòng)全球的重大突破有利于解決心臟移植供體不足和免疫排斥問(wèn)題，相信隨著3D打印心臟技術(shù)的成熟與應(yīng)用將成為心臟再生治療領(lǐng)域甚至醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最偉大的革命。

6 小結(jié)與展望

從傳統(tǒng)的藥物治療到手術(shù)治療，從干細(xì)胞移植到3D心臟打印，近年來(lái)心臟再生治療研究不斷取得突破性進(jìn)展，而心臟再生治療領(lǐng)域的新進(jìn)展也有利于臨床建立新的有效的衰竭的心臟再生治方法。目前，心臟再生領(lǐng)域?qū)Ω杉?xì)胞的研究已取得重大突破，雖然存在著缺陷、風(fēng)險(xiǎn)、爭(zhēng)議，但仍是心臟再生治療領(lǐng)域最主要的組成部分；多肽是最有前景心臟再生治療方法，而由于多種多肽通過(guò)打破ECM的平衡而促進(jìn)心臟損傷，因此多肽特異性抑制劑相關(guān)研究如火如荼。此外，心臟再生治療領(lǐng)域的一些新興研究不斷涌現(xiàn)，如中藥對(duì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)的促進(jìn)作用、miRNA對(duì)心臟細(xì)胞重生的促進(jìn)作用及3D打印心臟可能成為未來(lái)心臟移植的重要供體來(lái)源等，相信隨著心臟再生治療研究的不斷深入，未來(lái)瀕死心臟恢復(fù)跳動(dòng)的希望已經(jīng)不是夢(mèng)想。

作者貢獻(xiàn)：韓月進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，資料的收集、整理，撰寫(xiě)論文，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；朱莉負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；朱莉、宋桂仙進(jìn)行論文的修訂。

本文無(wú)利益沖突。