動物肝纖維化模型建立研究進展*

艾丁丁，羅偉生 ,蔣云霞

廣西中醫藥大學( 南寧530000)

慢性肝病是指發生在肝臟的病變過程，主要是指肝細胞的損傷和修復的循環過程，一般是指從肝炎到肝癌的過程，其中間環節為肝纖維化，而肝纖維化的核心機制在于肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC)的活化和凋亡[1],HSC的過量活化使得輔助生成膠原細胞和基底外細胞的物質大量形成,從而加速了肝纖維化的進程，使得肝纖維化向著肝硬化等不可逆的方向發展。而非酒精性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是慢性肝病發病的重要影響因素[2]，其中發生炎癥性病變的脂肪組織稱為“毒脂”對發展至肝炎之后肝纖維化病理過程中肝細胞的損傷和修復大有影響。目前，制作肝纖維化模型可效仿肝硬化模型的分類方法，但需針對目前肝纖維化病變以非酒精性原因增多為主進行針對性造模。近年來，許多學者主力制作標準的肝纖維化模型，多使用大鼠、小鼠或家兔，但本著動物造模應與人類的病變基本相似、肝纖維化分期過程明顯、造模的可重復性和簡便性等特點，故多使用大鼠進行肝纖維化造模[3]。

1 化學性損傷肝纖維化模型

化學性肝纖維化是由能造成肝毒性的化學物質所引起的肝細胞損傷和修復交替出現導致肝內結締組織異常增生的直接結果。造模所使用的常用藥物試劑為四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)、二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine,DMN)等物質，這類物質具有強烈的肝損害性，能夠在不同程度破壞肝臟細胞導致肝內結締組織異常增生。

1.1 四氯化碳誘導肝纖維化動物模型 四氯化碳(CCl4)是一種無色有機溶劑，對任何油脂具有極強的溶解性，尤其是動物油脂，因此，在人體表現為強肝毒性。CCl4通過和3,5-二乙氧基羰基-1,4-二氫可誘導肝細胞中的micro RNA基因，可導致肝細胞的損傷和再修復，出現肝纖維化[4]。CCl4作用于肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化發展的基礎，HSC激活和轉化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞迅速增殖發展為肝纖維化[5]，而肌成纖維細胞短時間內成倍堆積嚴重可致肝硬化甚至肝癌。此種病變的發展過程與人類慢性藥物性肝病的發展過程類似，因此，CCl4可用于探索藥物性肝纖維化的發病機理和評價抗肝纖維化藥物的臨床療效等實驗研究。CCl4誘導肝纖維化主要是影響體內的酶學變化和炎癥因子,從而改變了肝細胞損傷及再修復的過程[6]，且具有經濟實惠、可靠性和可重復性較高等優勢，成為了目前廣泛應用的肝纖維化動物造模方法的最佳體外試劑。但由于此單一造模方法成模率低，死亡率高[7]，所以現今多采用復合試劑或聯合方式造模。

1.2 二甲基亞硝胺誘導肝纖維化動物模型 DMN是一種世界公認的致癌有機化合物中間體成分，具有肝毒性、腎毒性和基因毒性等，其代謝后產物對肝臟細胞損傷較大，且易加速其纖維化速度，若不及時中止肝纖維化的過程，最終則形成肝細胞壞死致肝硬化。有Cheng等[8]研究人員用80%DMN(以生理鹽水稀釋)和SPF級大鼠，以0.5 ml/kg和2 ml/kg分為兩組模型組和一組空白對照組，每周進行兩次腹腔注射造模，在適應性喂養一周后開始造模，注射至第四周模型初步形成，到實驗結束時模型組總共存活27只，且無論高劑量組還是低劑量組肝臟重量均有增加。用上述方法制造的肝纖維化模型，肝組織主要出現肝門脈竇性狹窄、肝門周圍血管擴張、肝假小葉形成和肝細胞炎癥癥狀等，還有部分可見明顯的膠原纖維增生，最終形成肝纖維化，甚至嚴重者可出現肝硬化。DMN誘導的肝纖維化動物模型，其致肝纖維化的機制一般為炎癥反應和膠原蛋白的增生和沉積，近年還發現與脂肪代謝的異常相關[9]，而脂肪代謝異常還是非酒精性脂肪性肝病和非酒精性脂肪性肝炎的重要發生機制，故DMN也常用于肝炎和肝硬化的動物造模。但是DMN具有較強的肝毒性，且為日常重要的致癌物質之一，因此近年被國家明令列為管制藥物，即便是用于實驗動物造模也需獲得批準才能申購，因此，DMN近年來由于管制限制和毒性難以把握，才逐漸退出了一線肝病造模用藥行列。

2 酒精性肝纖維化動物模型

酒精性肝病(ALD)是指主要是受酒精損害較大使肝臟細胞出現脂肪的堆積、纖維化形成并逐步向肝硬化發展，如若在肝硬化之前不及時逆轉，則最終導致肝細胞不可逆死亡，還可發展為肝癌。因此，利用已知的肝病臨床癥狀，在與人體有相似機制的動物身上建模，研究其發病機制和病因，對現代肝病的分型和治療具有極大的意義。現代實驗研究，以急性酒精性肝纖維化動物造模和慢性酒精性肝纖維化動物造模，均多以小鼠造模為主，并且以急性酒精灌胃法造模較優[10]，此種造模方法能在短時間內使肝內細胞出現炎癥反應，引起肝血清酶ALT和AST的輕度升高，從而出現肝纖維化的病變，從而，也能有效的把動物模型控制在肝病可逆性強的肝纖維化的階段。而慢性酒精性肝纖維化小鼠造模因違反了動物天生厭惡酒精的天性，所以成模率低。也有研究表明，ALD動物模型主要只涉及輕度肝損傷(即脂肪變性和輕中度炎癥)而人類嚴重的酒精性肝炎往往發生在肝硬化環境中，甚至更嚴重者可發展至肝衰竭而導致死亡[11],因此，在現實中的酒精性肝纖維化動物造模，往往需要運用大鼠在慢性酒精性肝纖維化的基礎上，造成急性酒精性肝損傷，從而模擬現實人類復雜的肝病發生環境進行同等條件下模擬造模，但由于其操作程序的復雜性，造模成功率也較低，此方法也難于在實驗室環境下應用。

3 非酒精性肝病(NAFLD)

是指排除酒精和另外確切的肝臟損害病因所形成的肝臟細胞的損傷，其病理特點為肝內脂肪的大量堆積，從而導致肌纖維的過度增殖加劇肝纖維化的形成。近年來，學界認為NAFLD出現的肝細胞內脂肪過度沉積的現象還與胰島素抵抗相關[12]；也有研究表明，我國成人患NAFLD的患病率在某些地區有逐年增加的趨勢[13]，并且極易遷延他病。其主要的致病因素有胰島素抵抗、“二次打擊”學說[14]、免疫功能紊亂、慢性發展的炎癥性損傷、肝臟Kupffer細胞介導的促炎癥及加速脂質沉積作用等。因此，有必要建造真實、可靠的非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型，對此疾病的機制和病理過程進行研究。

3.1 血吸蟲肝纖維化動物模型 血吸蟲病是一種危害人體健康并且能引起肝細胞的損傷的人獸共患疾病[15]，血吸蟲卵在體內能不斷的刺激機體的免疫細胞并促使大量肝星狀細胞(HSC)聚積，形成以蟲卵為中心的炎性肉芽腫，其肉芽腫外周包裹著由肌成纖維細胞和膠原纖維異常增生的纖維，最終形成肝纖維化。但是，血吸蟲卵內分泌物刺激HSC具有兩面性，能同時激活HSC啟動肝纖維化程序，也能誘導HSC凋亡從而抑制肝纖維化[16]。因此，研究制作血吸蟲肝纖維化動物模型其重點在于認清血吸蟲卵內如何啟動和抑制HSC細胞的機制。孔慶明等[17]運用小鼠經腹部剃毛貼片感染血吸蟲尾蚴建立肝纖維化動物模型，16周后應用HE染色和馬森染色評估肝臟纖維化程度證明造模成功，肝臟中蟲卵附著的肉芽腫較大。也有實驗研究發現，通過對脾臟質量指數的評估比肝臟質量指數更能反應肝纖維化的程度。但是此方法造模周期長，且血吸蟲為人獸共患感染物，對實驗人員及實驗室操作要求較高。目前，對血吸蟲性肝纖維化的造模最佳動物為小鼠，但如果采用年齡較小的小鼠容易造成在造模前期就出現批量死亡，從而影響實驗成模率，因此，此造模方式僅用于實驗室研究抗血吸蟲藥物的開發和血吸蟲影響肝纖維化機制的小范圍實驗。

3.2 高脂類肝纖維化動物模型 高脂類肝纖維化是指主要由于營養失調性引起的非酒精性脂肪性肝病，患者由于飲食習慣和生活方式的改變而長期攝入過量的含脂肪類物質，從而導致肝臟脂肪過度沉積改變肝臟內肝細胞的構造形成肝纖維化。由于現代人物質生活越來越好，攝入過多的脂肪、糖類等物質的機率逐漸增加，所以，建立高脂類肝纖維化動物模型用于研究人類脂肪性肝病有著極為相通的病變基礎。高脂類肝纖維化動物模型的建造一般采用雄性SPF級小鼠，體重在20 g左右為宜[18]，也可采用家兔造模。一為配方合成高脂飼料造模：配方常以飼料為基本營養來源所占比例約為80%，再加入10%～15%油類物質如調和油、1.5%膽固醇和0.5%膽鹽及微量元素等，造模6周后取小鼠血清，檢驗肝功能、甘油三酯和總膽固醇等指標驗證造模結果，若出現肝組織內彌漫性分變脂肪滴分布全肝，可視為造模成功。二為配方元素缺乏高脂飼料造模：一般采用60%～80%的高脂膽堿缺乏飼料，先適應性喂養，隨后分別在第4周、8周、16周隨機處死5只小鼠驗證造模結果，一般于第6周開始出現肝纖維化[19]。此種造模方式簡單易行，可重復性強，其動物模型與人體內肝臟的內環境病變及其相似，可有效的進行高脂類肝纖維化肝病的病理機制和用藥研究。

4 復合型損傷肝纖維化模型

隨著社會生活水平的發展，現代人的生活具有一定的復雜性，從而導致肝病的因素復雜多變，甚至是多種復合性因素共同影響肝病的形成和發展，尤其是肝纖維化是肝病的轉歸發展的中心環節。因此，建立復合型損傷的肝纖維化動物模型極具臨床必要性和符合肝病流行病學發展的需求。建立復合型肝纖維化模型采用乙醇灌胃、高脂飼料喂養、高糖飲水等復合因素，并結合腹腔注射CCl4的改良版聯合方法造模。采用標準SD級大鼠，體重在200 g左右，在適應性喂養1周之后用此方法分組造模8周，在第4周和第8周分組隨機抓取5只大鼠取標本進行病理學、肝功能指標檢測，第8周后模型組、對照組大鼠均形成肝纖維化。此種造模方法的優點是可以在短時間內建立可重復性高、穩定性強的肝纖維化模型。同時，在一定程度上解決了單一因素的動物模型與現代臨床患者病情有差距的問題，復合型肝纖維化動物模型的成模率高，動物在造模期間的病死率較低。

5 小結與展望

簡單來說，建立動物模型的對研究人類疾病有著很好的幫助，能使我更好的研究肝纖維化的機制和進行新藥抗纖維化的開發研究。但是，由于動物本身和人體系統還是具有一定的生物學，導致動物模型也不能完全代替人體用來進行更精確的病程研究。近來，有數據表明，人體機體的老化也會影響慢性肝病，特別是對慢性肝病晚期的血液循環和肝纖維化產生影響[20]。然而，我們目前較為成熟和廣泛應用的肝纖維化動物模型絕大部分是使用成年的或幼年的小鼠、大鼠或家兔進行基礎建模，此種方法下建立的肝纖維化模型是否能有效研究老年化肝纖維化病變的發展仍未可知。

綜上所述，目前仍然沒有一種肝纖維化模型能夠完整體現人類肝纖維化的病程發展特點。然而，動物模型能夠幫助我們研究疾病的病因和病理特性，提出新的病因假說和治療方法。隨著現代對建模方式的不斷改良，有望建立客觀、可控性強和可重復性高的肝纖維化動物模型，能更好的研究肝纖維化的發病機制，尋求更好的逆轉纖維化進程的藥物，從而及時截斷肝纖維化向肝硬化甚至慢性肝病的終末病程發展的大趨勢。