辣木葉多酚的超聲輔助雙水相提取工藝優化及其抗氧化活性評價

董 樂，王 芳，李小琴，梁文文

（泉州師范學院 海洋與食品學院，福建泉州362000）

植物多酚（plant polyphenol）為廣泛存在于植物體內的具有多元酚結構的一類次級代謝物［1]，具有諸如抗氧化性、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗輻射、抗骨質疏松、抑制心血管疾病、降血脂和降血糖等多種生物活性［2-7]，因對健康的有益作用而備受關注［8].植物多酚的提取主要采用水溶液或者醇水溶液室溫冷浸等傳統方法，但提取率較低［9-10].雙水相萃取體系是由兩種互不相溶的水溶液組成［11]，是根據兩相間的選擇分配不同進行提純，提取環境溫和，不會導致生物活性物質的變性或是失性，傳質速率快，能夠實現快速分離［12].近年來，采用雙水相萃取技術從不同植物中提取多酚化合物研究的報道很多［13].在溶液萃取體系基礎上，采用超聲波、微波等輔助提取方法能夠有效提高植物多酚的提取率和純度.超聲波輔助提取技術因具有特殊的作用機制，能夠獲得理想的提取效果，故備受關注［14].植物化學成分的提取和純化工藝涉及多種影響因素.響應面法（RSM）是利用合理的試驗方法并通過試驗得到一定的數據，將各因素與響應值之間的函數關系以多元二次回歸方程方式進行擬合，通過對回歸方程和響應面分析獲得最佳工藝條件［15].該方法可以快速而有效地確定多因素系統的最佳條件，并已應用于多種優化實踐中［16-18].

辣木（Moringa oleiferaLam.）又稱鼓槌樹（Drumstick tree），為辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa）的多年生熱帶落葉喬木，目前廣泛分布于印度、中國、日本等30多個熱帶及亞熱帶的國家和地區［19].辣木富含多酚類化合物［14].對辣木籽的多酚提取工藝研究已有報道［20-23]，但均是以乙醇或正丙醇單一溶劑作為提取劑［24-26].且一般就利用度而言，辣木葉相對較高.本試驗以多酚提取率為評價指標，以硫酸銨用量、正丙醇體積分數、液料比、超聲時間和超聲溫度為自變量，在單因素試驗基礎上通過與響應面法中的Box-Behnken 設計優化辣木葉多酚的超聲波輔助正丙醇-硫酸銨雙水相提取工藝；通過抗氧化能力指數（ORAC）和對羥基自由基（OH·）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）和2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS·+）的清除能力來評價其抗氧化活性，從而為辣木葉多酚的高效提取及辣木葉的精深加工利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料 辣木由福建安溪師竹軒園藝有限公司提供.

1.2 試驗試劑 水溶性維生素E（Trolox，生物級）：美國Sigma-Aldrich 公司；偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH，生物級）、DPPH·（生物級）、ABTS·+（生物級）：aladdin 公司；熒光素鈉（FL，生物級）：上海MACKLIN 公司；沒食子酸標準品（GAD，分析純）：中國藥品生物制品鑒定所；Folin-Ciocalteu 試劑（分析純）：美國sigma公司；其余試劑（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司.

1.3 儀器設備 3635 型96 孔紫外微孔板：美國Corning 公司；酶標儀：Infinite PROM-200 型，瑞士Tecan公司；紫外-可見分光光度計：TU-1950型，北京普析通用儀器有限責任公司；梯度混合器：TH-1000型，上海青浦滬西儀器廠.

1.4 方法

1.4.1 辣木葉粉末的制備 辣木葉用自來水清洗，并自然風干.經高速粉碎機粉碎，將過80目篩后的辣木葉粉末裝袋，置于干燥器中保存，備用.

1.4.2 水分含量的測定 按中華人民共和國國家標準GB 5009.3-2016測定［27].

1.4.3 雙水相體系的構建 稱取一定質量的硫酸銨，用去離子水溶解后加入正丙醇，充分混合直至兩相形成［28].

1.4.4 多酚的提取流程 稱取辣木葉粉末后，在不同提取條件下用超聲波輔助雙水相法充分混合靜置1 h，超聲提取，濾過，濾液置于分液漏斗中靜置分層后，取上層醇相清液，蒸干，溶解，轉移至50 mL容量瓶中，定容，即得供試溶液.

1.4.5 多酚含量測定 按參考文獻［29]測定.

1.4.6 提取工藝的單因素試驗 通過預試驗確定辣木葉多酚粗品單因素的基本條件為：硫酸銨用量為0.3 g·mL-1、正丙醇體積分數（V·V-1）為60%、液料比為20∶1（V·m-1，mL·g-1）、超聲提取時間為50 min、超聲提取溫度為50 ℃.通過改變其中一個變量、固定其他因素不變，分析各個單因素對辣木葉多酚提取率的影響.液料比對辣木葉多酚提取率的影響：稱取1.00 g辣木葉粉末，固定超聲時間50 min，超聲溫度60 ℃，正丙醇體積分數為60%，硫酸銨用量為0.3 g·mL-1，分別考察液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1（V·m-1，mL·g-1）水平對多酚提取率的影響.硫酸銨用量對辣木葉多酚提取率的影響：分別考察硫酸銨用量為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·mL-1水平對辣木葉多酚提取率的影響.超聲提取溫度對辣木葉多酚提取率的影響：分別考察30、40、50、60、70 ℃5個水平對辣木葉多酚提取率的影響.正丙醇體積分數對辣木葉多酚提取率的影響：分別考察正丙醇體積分數（V·V-1）為20%、40%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、100%9個水平對辣木葉多酚提取率的影響.超聲時間對辣木葉多酚提取率的影響：分別考察超聲時間為30、40、50、60、70 min 5個水平對辣木葉多酚提取率的影響.

1.4.7 提取工藝的Box-Behnken響應面優化試驗 根據預試驗和單因素試驗的結果，固定硫酸銨用量為0.3 g·mL-1，采用統計分析軟件Design-Expert 8.0.6 中Box-Behnken Design 試驗設計原理設計響應面試驗，以超聲時間、超聲溫度、液料比和正丙醇體積分數為自變量，以辣木葉多酚提取率為評價指標，建立4因素3水平的響應面分析法，進行二次多項回歸擬合及其優化分析，其水平編碼表見表1.

表1 試驗因素與水平設計Tab. 1 Experimental factors and level design

1.4.8 辣木葉多酚的抗氧化活性測定 ORAC 的測定按參考文獻［30]，OH·清除率的測定按參考文獻［31]，ABTS·+清除率的測定按參考文獻［32]，DPPH·清除率的測定按參考文獻［33].

1.4.9 數據處理 所有試驗均為3次重復，結果以平均值±標準差表示.抗氧化試驗對照組以等體積維生素C（VC）代替樣品溶液其余同樣品組.采用Excel 2016和Design - Expert 8.0.6軟件進行作圖.

2 結果與分析

2.1 辣木葉粉末中水分含量 根據測定的結果，辣木葉粉末中水分含量為3.42%±0.04%.

2.2 多酚含量測定的線性回歸方程 根據測定的結果，吸光值A（y）與沒食子酸質量濃度（x，μg·mL-1）在0.00～5.83 μg·mL-1內的線性回歸方程為y = 0.0846x－0.0090（R2＝0.9992），說明線性關系良好.

2.3 單因素試驗

2.3.1 液料比對辣木葉多酚提取率的影響 由圖1可知，液料比在20∶1～50∶1（V·m-1，mL·g-1）范圍內，隨著液料比的增大，辣木葉多酚的提取率隨之增大，當液料比提高到50∶1（V·m-1，mL·g-1）時，辣木葉多酚提取率達到最高；當液料比繼續提高時，提取率基本保持平緩且略呈下降趨勢.這是由于提取過程中隨著提取溶劑的增大，傳質的動力就越大，使得辣木葉中多酚物質更容易溶出.但是，隨著液料比的增大，產生同樣熱量時提取溫度相應會下降，從而使提取率下降［33].因此，辣木葉多酚提取工藝的最佳液料比選擇50∶1（V·m-1，mL·g-1）.

2.3.2 硫酸銨用量對辣木葉多酚提取率的影響 由圖2可知，硫酸銨用量在0.1～0.3 g·mL-1范圍時，辣木葉多酚提取率隨硫酸銨用量的增加而增高，當硫酸銨用量達到0.3 g·mL-1時，辣木葉多酚的提取率達到最高.當硫酸銨用量繼續增加時，辣木葉多酚的提取率卻隨之下降.因此，辣木葉多酚提取工藝的最佳硫酸銨用量選擇0.3 g·mL-1.

2.3.3 正丙醇體積分數對辣木葉多酚提取率的影響 由圖3可知，在不同體積分數的正丙醇與一定質量的硫酸銨形成的雙水相體系中，當正丙醇體積分數增加至80%時，辣木葉多酚的提取率達到最高，當正丙醇體積分數超過80%時提取率開始下降，原因可能是因為正丙醇體積分數過大，使親脂性物質大量溶出，從而使通透性下降，干擾因素也隨之增大［34].因此，辣木葉多酚提取工藝的最佳正丙醇體積分數選擇80%.

2.3.4 超聲提取溫度對辣木葉多酚提取率的影響 由圖4可知，當超聲提取溫度在30～50 ℃時，辣木葉多酚的提取率隨超聲提取溫度的升高而增加，提取率在超聲提取溫度為50 ℃時達最高值.當超聲提取溫度進一步增加時，辣木葉多酚的提取率卻開始降低.其原因在于，超聲提取溫度超過該范圍，可能造成多酚類物質不穩定，會發生降解和（或）部分氧化.因此，辣木葉多酚提取工藝的最佳超聲提取溫度選擇50 ℃.

2.3.5 超聲提取時間對辣木葉多酚提取率的影響 由圖5可知，當超聲提取時間分布于20～50 min時，隨著超聲提取時間的增加，辣木葉多酚的提取率增高，當超聲提取時間為50 min 時多酚提取率達最高值，當提取時間繼續增大時，辣木葉多酚的提取率隨著時間的增大反而減小.這是因為在剛開始提取時，辣木葉細胞破碎程度增大，辣木葉中的多酚物質逐步溶出，辣木葉中的酚的量是固定的，當達到一定時間后，辣木葉多酚類物質的溶出量接近固有值，因此，即使提取時間繼續增加，多酚類物質溶出微乎其微甚至不會溶出；并且隨著時間的增加，已溶出的多酚類物質可能會發生氧化，導致多酚提取率的測定值會比實際含量低［35].因此，辣木葉多酚提取工藝的最佳超聲時間選擇50 min.

2.4 Box-Behnken 響應面試驗結果 以提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）和正丙醇體積分數（D）為自變量，以提取率為評價指標，利用響應面分析法對辣木葉多酚提取工藝進行優化.試驗設計、試驗結果見表2.

表2 Box-Behnken響應面試驗設計及分析Tab. 2 Box-Behnken response surface test design and analysis

根據響應面試驗結果（表2），試驗結果采用Design-Expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合后，建立了A、B、C和D共4因子的數學回歸模型為：

對試驗結果進行回歸方差分析結果見表3.由表3可知，該模型P（Pro＞F）為＜0.0001，表明模型極顯著，其失擬項P值是0.0616，表明失擬項不顯著，該模型是穩定.由表3的回歸系數顯著性檢驗可知，A、B、C、D 4個因素對辣木多酚提取影響極顯著（P＜0.01），BC、BD兩兩交互之間對多酚提取率的影響極顯著（P＜0.01），AC、AD兩兩交互之間對多酚提取率的影響顯著（P＜0.05），A2、B2、C2、D2對多酚提取率的影響極顯著（P＜0.01）.

表3 回歸方程顯著性檢驗和方差分析Tab. 3 Significance test and variance analysis of regression equation

響應面中的等高圖直觀地反映出各因素交互作用對響應值的影響，見圖6～圖9.

由圖6-A 可知，當提取溫度一定時，隨液料比的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢為先增加后減小，當液料比為52.5∶1（V·m-1，mL·g-1）時，辣木葉多酚的提取率達最高值；在液料比一定時，隨溫度的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢為先增加后減小，當提取溫度為51 ℃時，辣木葉多酚的提取率達最高值.提取溫度和液料比對辣木葉多酚的影響近似橢圓，說明有交互作用（圖6-B）.

由圖7-A可知，當提取溫度一定時，隨正丙醇體積分數的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢為先增加后減小，當正丙醇體積分數為78%時，辣木葉多酚的提取率達最高值；在正丙醇體積分數一定時，隨溫度的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢為先增加后減小，當提取溫度為51 ℃時，辣木葉多酚的提取率達最高值.提取溫度和正丙醇體積分數比對辣木多酚的影響近似橢圓，說明有交互作用（圖7-B）.

由圖8-A 可知，當提取時間一定時，隨液料比的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢為先增加后減小，當液料比在50∶1（V·m-1，mL·g-1）時，辣木葉多酚的提取率最高；在液料比一定時，隨提取時間的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢為先增加后減小，當提取時間為50 min時，辣木葉多酚的提取率最高.提取時間和液料比對辣木葉多酚的影響近似橢圓，說明有交互作用（圖8-B）.

由圖9-A可知，當提取時間一定時，隨正丙醇體積分數的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢為先增加后減小，當正丙醇體積分數為78%時，辣木葉多酚的提取率達最高值；在正丙醇體積分數一定時，隨提取時間的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢為先增加后減小，當提取時間為50 min時，繼續增加時間辣木葉多酚提取率略有減少，在提取時間為50 min時，辣木葉多酚的提取率達最高值.提取時間和正丙醇體積分數對辣木葉多酚的影響近似橢圓，說明有交互作用（圖9-B）.

2.5 最佳工藝及其驗證試驗 根據上述數學回歸模型計算出最佳工藝條件：硫酸銨用量為0.3 g·mL-1，正丙醇體積分數為78%，液料比為52.5∶1（V·m-1，mL·g-1），超聲時間為50 min，超聲溫度為51 °C，預測值為3.17%.在此條件下提取辣木葉多酚，重復進行4 次平行試驗，實際測得辣木多酚的提取率為3.20%±0.02%.預測值與實際理論值接近，模型預測值在實際值的誤差范圍之內.說明采用響應面法優化得到的辣木多酚的工藝條件參數具一定的可靠性.

2.6 體外抗氧化活性評價 由表4可知，辣木葉多酚的ORAC值高達8296±76 μmol TE·g-1，且具有清除OH·、DPPH·和ABTS·+的能力，且清除OH·的半數清除濃度（IC50）值小于維生素C（VC）的值，清除DPPH·的IC50值與VC的值無顯著性差異，即辣木葉多酚清除OH·和DPPH·的效果分別優于或接近VC的效果.

表4 辣木葉多酚的體外抗氧化能力評價Tab. 4 Evaluation of antioxidant activity in vitro of polyphenols from leaves of M. oleifera

3 討論與結論

利用超聲波輔助正丙醇-硫酸銨雙水相法提取辣木葉多酚，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken 設計-響應面法（RSM）優化辣木葉多酚提取的最佳工藝參數為：硫酸銨用量0.3 g·mL-1，正丙醇體積分數78%，液料比52.5∶1（V·m-1，mL·g-1），超聲時間50 min，超聲溫度51 °C.數學回歸模型為：Y=2.840+0.062A+0.130B+0.140C-0.067D-0.045AC-0.055AD+0.180BC-0.160BD+0.047CD-0.410A2-0.390B2-0.420C2-0.760D2.在此工藝下，辣木葉多酚提取率為3.20%±0.02%.裴斐等［24]采用超聲波輔助蒸餾水法提取辣木葉多酚，而符穩群等［25]采用超聲波輔助乙醇法提取，獲得多酚提取率分別為2.514%和2.732%.本研究中獲得的提取率比上述二種方法的提取率分別高出0.686%和0.468%，因此采用雙水相法提取辣木葉多酚會顯著提高其提取率.

抗氧化效果的體外化學評價通常采用的指標包括ORAC法、OH·清除法、ABTS·+清除法、DPPH·清除法、超氧陰離子（O2·-）清除法和鐵離子還原能力（FRAP）法等多種方法.不同物質的化學與生物學性質差異很大，不同體外測定方法的原理不同，同一種物質清除各種自由基的能力不同；即使同一種物質采用不同的評價方法結果也不同，因此在評價一種物質的抗氧化效果時通常采用多種方法進行綜合評價.ORAC法是基于物質供氫能力的一種測定方法，與人類生物學相關性最大，所得到的抗氧化能力更能反映物質在體內的相關作用，目前普遍應用于對各種物質的抗氧化評價［36].本研究中不僅辣木葉多酚的ORAC 值高達8296±76 μmol TE·g-1，且其清除OH·、DPPH·的效果分別均優于或接近VC的效果，該結果顯著高于裴斐等［24]提取的辣木葉多酚清除OH·、DPPH·的效果，這應該與雙水相法能起到純化的作用有關.

綜上所述，通過超聲波輔助雙水相法提取的辣木葉多酚已經具有較強的體外抗氧化活性，是一種良好的天然抗氧化劑.但針對辣木葉多酚分離純化、體內活性測定及活性機理還需進一步研究.