冠心病血瘀證免疫炎癥機制研究擷要＊

王靖怡，李 軍，陳恒文，劉詠梅，潘菊華，王 階

（中國中醫科學院廣安門醫院 北京 100053）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是指由于冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄、痙攣或阻塞導致心肌缺血、缺氧或壞死而引發的心臟病，統稱為冠狀動脈性心臟病或冠狀動脈疾病，是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型。免疫炎癥機制在動脈粥樣硬化發生發展過程中發揮重要作用[1]，近年來已成為研究聚焦熱點之一[2，3]。中醫認為冠心病屬“胸痹心痛”范疇，多以血行不暢、心血瘀阻為其主要病機[4]。一項冠心病現代中醫證候特征臨床流行病學調查顯示，血瘀證為冠心病患者最常見的證候要素，占比高達77.89%[5]。冠心病血瘀證患者免疫功能往往易呈現紊亂狀態[4]。因此，從免疫炎癥角度入手對冠心病血瘀證進行研究，有助于擴展冠心病血瘀證證候內涵及實質，充分發揮活血化瘀藥物的臨床療效。

1 冠心病血瘀證免疫炎癥多組學研究成果

2000年以后，冠心病血瘀證研究重點逐步轉向多組學研究，涉及基因組學、表觀遺傳學、蛋白組學、轉錄組學等方向[6]。這些由組學構建起的多靶點網絡，可以基于病證本身復雜性，從而更全面地構建冠心病血瘀證證候的潛在分子網絡機制。這也是在早期單純觀察炎癥或免疫反應相關指標變化的基礎上，進一步挖掘其背后的直接分子機制，做到“知其然更要知其所以然”。

基因組學（Genomics）是用于繪制生物體內所有基因、分析核苷酸序列、進行基因定位及功能注釋分析的新興學科。一些學者利用基因組學方法從分子水平對冠心病血瘀證證候實質進行探索，發現免疫炎癥反應在冠心病血瘀證中具有重要地位。一項基于基因組學開展、運用差異顯示方法研究冠心病血瘀證患者外周血白細胞mRNA 的研究顯示，研究中所獲得的3 條（b13、49b、23b）與人類基因100%同源基因中，顯著高表達的b13 表達于T 淋巴細胞及B 淋巴細胞表面，是淋巴細胞激活信號分子家族成員1（SLAMF1），主要參與炎癥反應[7]。另有研究者利用基因芯片技術，對家系冠心病血瘀證和家系冠心病非血瘀證患者進行差異基因表達譜構建，發現家系冠心病血瘀證相關差異基因共有8 個（其中上調4 個，下調4 個），結合KEGG 通路分析發現差異主要涉及免疫炎癥過程相關的白細胞介素、補體系統、內皮細胞黏附因子等[8]。

表觀遺傳學（Epigenetics）目前是心血管領域的研究熱點，可用于解釋基因與環境間的交互作用。從該角度探討冠心病血瘀證實質主要包括非編碼RNA 調控和DNA 甲基化修飾。研究發現miRNA 在冠心病血瘀證免疫炎癥過程中發揮作用，在不穩定型心絞痛血瘀 證 患 者 中，miR-146b-5p 和miR-199a-5p，以 及CALR 和TP53 均可以作為潛在的生物標記物參與減輕炎癥反應和調控凋亡的病理機制[9]。相關研究表明，同樣作為非編碼RNA 的某些特定lncRNA 的表達水平變化與冠心病血瘀證免疫炎癥通路密切相關，如冠心病血瘀證lncRNA 調控網絡中的關鍵節點CTA-384D8.35、CTB-114C7.4、RP11-567M16.6 和has-miR-3158-3p，都與免疫炎癥相關[10]。亦有研究者利用高通量芯片技術，通過篩選CHD 血瘀證、瘀毒輕證、瘀毒重證及健康對照組差異miRNA 和lncRNA，并進行功能學分析，發現差異miRNA 參與免疫炎癥反應過程，差異lncRNA 與炎癥及免疫等生物學過程相關，提示miRNA及lncRNA均參與了CHD血瘀證的免疫炎癥反應[11]。中醫證候與DNA 甲基化關系密切[12]，在冠心病血瘀證甲基化相關研究中也發現，通過對CHD 不穩定型心絞痛血瘀組和非血瘀組患者外周血細胞中白細胞介素-6（IL-6）基因啟動子區甲基化狀態進行分析，發現血瘀證組患者IL-6水平高于非血瘀組[13]。

2 多種免疫炎癥反應環節參與冠心病血瘀證

除上述多組學研究中涉及的分子（包括DNA 和非編碼RNA）及其相關修飾機制外，免疫炎癥反應過程中的諸多環節亦會參與到冠心病血瘀證中，具體涉及免疫細胞、炎癥因子及生物標志物、免疫炎癥相關信號通路等不同方向。

2.1 免疫細胞

冠心病是一種以動脈粥樣硬化為基礎，脂質聚集、免疫細胞浸潤和纖維脂肪斑塊形成為特征的炎癥過程[14]，相關免疫細胞通過關聯機制參與其形成過程。沉積的脂質通常被認為是炎性反應初始觸發信號[15]，通過募集使單核細胞分化成為巨噬細胞，進而吞噬氧化的脂質形成泡沫細胞，分泌相關細胞因子及趨化因子，促進免疫（淋巴）細胞的浸潤與活化。淋巴細胞在炎癥免疫過程中的作用不同，T 細胞介導機體適應性細胞免疫，B細胞產生特異性抗體發揮體液免疫作用，自然殺傷（NK）細胞在固有免疫應答中發揮重要作用，可直接殺傷某些細胞，上述3種細胞亞群構成淋巴細胞亞群，其水平失衡與血瘀證關系密切，尤以T細胞亞群為關注熱點[16，17]。根據T 細胞表達不同，可分為CD4+T 細胞和CD8+T 細胞，二者因各自所分泌不同的細胞因子而具備不同的免疫功能。正常情況下，CD4+T 細胞、CD8+T 細胞以及CD4+T/CD8+T 比值處于正常范圍內，相互反饋調節并維持動態平衡狀態，而其數量及比值的改變往往用來表示機體免疫功能的變化[18，19]。一項早期的冠心病血瘀證研究中顯示，冠心病血瘀證患者的CD4+T 細胞水平降低，CD8+T 細胞水平高于正常人，二者比值下降，提示患者免疫功能降低[20]。

網絡驅動綜合分析顯示B細胞免疫應答是冠心病（CHD）的致病因素[21]。B 細胞受到抗原刺激后會增殖分化形成漿細胞，后者可合成、分泌抗體，發揮免疫防御、穩定和監視等功能。隨著研究的不斷深入，研究者們逐漸認識到B細胞多種亞型可在動脈粥樣硬化中發揮特定作用，其分泌的特異性IgM 抗體對CHD 有保護作用且不依賴補體系統[22]，B 細胞特定亞型可通過CD4+T 細胞相關機制促進動脈粥樣硬化[23]，調節性B細胞可以通過產生白介素-10（IL-10）、白介素-12（IL-12）或轉化生長因子-b（TGF-b）等，與致病性T 細胞作用，發揮調節免疫應答的功能，對動脈粥樣硬化的形成與發展發揮重要作用[24，25]。此外，冠心病血瘀證患者存在明顯的B 細胞比例失調，低水平B10 細胞與冠心病血瘀證密切相關[26]。

2.2 經典炎癥因子及生物標志物

2.2.1 CRP/hs-CRP與ICAM-1

CRP 是由肝細胞產生的急性時相蛋白，作為一種敏感的非特異性炎癥標志物，可以直接發揮促炎效應，介導和刺激相關炎性因子的釋放與表達[27]，其與冠心病的關系已得到較為廣泛的認證，因此一般作為經典的炎癥因子觀察指標。目前CRP 已成為冠心病發病的獨立危險因素及較敏感的預測因子，這在一定程度上也反映了冠心病發生、發展及預后進程中炎癥反應的重要作用。有相關研究[28]通過對比冠心病血瘀證患者及正常對照組hs-CRP 水平，發現冠心病血瘀證組hs-CRP 明顯高于健康對照組，認為hs-CRP 可作為較靈敏的慢性炎癥標志物，用于評價冠心病血瘀證病理過程，指導臨床治療，判斷預后療效等，也為冠心病血瘀證診療客觀化提供了重要依據。另有研究[29]基于CRP 可上調細胞間粘附因子（ICAM-1）表達，從而促進動脈壁內多種細胞和循環中單核細胞分泌炎癥因子的作用，發現冠心病血瘀證患者血清hs-CRP 及ICAM-1 水平均明顯高于正常對照人群，認為二者與冠心病血瘀證及炎癥反應存在著一定的關聯。

2.2.2 IL-8、IL-6

IL-8 作為經典的炎癥趨化因子，無論從基因還是蛋白質水平均可檢測到IL-8 存在于冠狀動脈粥樣硬化血管損傷處，其在動脈粥樣硬化發生及進展的各個階段均發揮重要作用[30]。有研究發現冠心病血瘀證差異基因IL-8具有激活血小板的作用，在一定程度上影響血小板黏附、聚集及釋放功能[31]。在此基礎上，有研究發現冠心病血瘀證患者血清IL-8水平明顯升高，并揭示其參與冠心病血瘀證形成的可能機制包括：①通過活化粘附分子MAC-1促進白細胞與血小板聚集；②誘導血小板與中性粒細胞、單核細胞聚集并促進表達具有促凝活性的組織因子；③可通過與血小板上受體CXCR1 結合直接誘導血小板活化[32]。IL-6 與心血管事件的危險性相關，患者血漿IL-6水平每上升一個四分位數，發生心肌梗死的危險性將升高38%。有研究顯示，IL-6 在CHD 血瘀證患者與非CHD 組患者之間存在顯著差異，通過神經網絡分析發現IL-6對血瘀證影響較大[32]。

2.2.3 TNF-α、IFN-γ

TNF-α作為一種兼具多種生物功能的促炎細胞因子，由巨噬細胞和脂肪細胞產生。其可活化內皮細胞進而促進炎癥細胞的聚集和動脈粥樣硬化的形成，具體過程為斑塊內巨噬細胞分泌的TNF-α對內皮細胞具有直接毒性，從而引起炎癥反應進一步損傷血管內皮，并可上調粘附分子，形成更多的巨噬細胞并產生更多的TNF-α，這種循環結果可促進穩定型斑塊向不穩定型斑塊轉化[33，34]。相關研究顯示冠心病血瘀證患者采用加味血府逐瘀湯治療前后TNF-α等炎癥因子下降程度明顯，體現了活血化瘀中藥具有一定的抗炎作用[35]。IFN-γ本身作為一種致炎性細胞因子，也可以介導免疫炎癥的發生，可以由Th1 細胞、單核-巨噬細胞、NK 細胞等多種細胞合成及分泌，既可以直接發揮致炎作用，活化內皮細胞，加重血管內皮損害，也可間接通過激活巨噬細胞等，促進IL-6、TNF-α等其他炎癥因子的產生，進而促使動脈粥樣硬化形成，其作用的發揮往往可通過多個信號通路實現[36，37]。有研究[38]顯示，冠心病心絞痛患者與健康對照組相比，IFNγ水平明顯升高，而不穩定型心絞痛IFN-γ水平則明顯高于穩定型心絞痛，提示IFN-γ與冠心病及其嚴重程度關系密切。在此基礎上發現，冠心病血瘀證患者IFN-γ較非血瘀證患者明顯升高，且二者呈正相關趨勢，表明冠心病血瘀證與IFN-γ存在一定的相關性。

2.2.4 其他

一項對冠心病血瘀證遺傳相關差異基因篩選及功能路徑分析研究顯示，家系冠心病血瘀證患者差異基因表達主要涉及6 類基因系表達改變，主要以炎癥因子為主（具體包括趨化因子家族、白介素細胞因子和補體等）。此外，基質金屬蛋白酶系（MMPs）中表達上調的MMP-9 主要參與白細胞跨內皮遷移，影響炎癥免疫系統[39]。補體IgG、IgA、IgM 的水平異常也可提示冠心病血瘀證患者體內免疫功能可能處于紊亂狀態，炎癥反應可能較為劇烈。

2.3 免疫炎癥相關信號通路

盡管信號通路以研究機體調控網絡為主，探究生物分子間的相互作用及傳遞規律，但其中蘊含的整體觀念與中醫學證候復雜性的特點不謀而合[40]。早期研究通過對冠心病血瘀證和非冠心病血瘀證患者的差異基因進行篩選，將其交集視為血瘀證相關差異基因，發現與炎癥免疫相關的基因有5 個，5 條信號通路涉及炎癥免疫反應，由此推論炎癥及免疫反應可以在某種程度上介導和參與血瘀證的發生發展過程[41，42]。

現代醫學認為，核因子-κB（NF-κB）可以通過調控眾多靶基因的轉錄及表達，從而在炎癥反應及免疫應答等諸多生理過程中間環節發揮重要作用。有研究顯示冠心病不穩定型心絞痛血瘀證患者外周血CD14+單核細胞中Toll 樣受體-2、Toll 樣受體-4、NFκB 表達明顯高于冠心病不穩定型心絞痛非血瘀證患者，采用丹參酮IIA 磺酸鈉注射液進行治療后，可能通過抑制TLRs/MyD88/NF-κB 信號通路，發揮抑制炎癥因子釋放、穩定斑塊及緩解心絞痛等作用[43]。在冠心病血瘀證DNA 甲基化研究中發現，miR194 promoter/miR194/MAPK 信號通路是整個DNA 甲基化-miRNAmRNA 調控網絡中的關鍵節點，該調控軸與免疫炎癥反應相關，通過臨床試驗驗證發現，血瘀證改善后，該關鍵節點也隨之發生變化[44]。

2.4 其他

最早有相關臨床研究基于紅細胞免疫功能改變，并應用冠心II 號方進行干預，以探討冠心病血瘀證免疫學實質。紅細胞具有免疫粘附功能，其表面存在免疫粘附受體（補體C3b 受體）可以吸附抗原-抗體所形成的免疫復合物，并在血循環中經肝臟網狀內皮系統清除。該過程可以使C3b 降解失活變性，并主要集中在血管中央血流部位，有效減少免疫復合物沉積與內皮細胞直接接觸所導致的炎癥反應。研究結果顯示，冠心病血瘀證確實存在紅細胞免疫功能改變，其RBC-C3b受體花環率顯著高于正常對照組，而經過冠心II 號方治療后，除心絞痛癥狀改善、血瘀體征減輕或消失等，其RBC-C3b 受體花環率也隨之下降，考慮冠心II 號方可能通過改善紅細胞受體免疫粘附活性，調節其免疫功能，進而達到控制心絞痛癥狀發作、改善心肌功能的作用[45]。

3 活血化瘀中藥發揮調節免疫及抗炎作用

已有血瘀證相關研究多圍繞“血”與“脈”兩方面開展，涉及血流動力學、血液流變學、血小板形態功能、血管內皮細胞、微循環等內容[46-48]。早在1974年，天津南開醫院首次通過觀察活血化瘀藥對幾種不同實驗性炎癥過程的影響，證實這些藥物具有抗炎功效[49]。這可以視為血瘀證與免疫炎癥關聯認識的初步嘗試。此后一段時間內，血瘀證與炎癥免疫反應的相關性研究多圍繞活血化瘀藥與炎性疾病開展。直至2007年，相關學者發現并正式提出，動物及臨床研究中，血瘀證與炎癥之間的關系密切，炎癥免疫反應可以從特定角度對血瘀證實質進行揭示[50]，這也使血瘀證與炎癥免疫反應的相關性得到關注，并為后續研究提供了基礎和方向。

針對血瘀證，中醫多采用活血化瘀藥物進行對證治療。大量臨床觀察及基礎研究顯示活血化瘀藥物可以通過調節血流動力學、改善血管管壁通透性、調整促炎及抗炎細胞因子等方面，綜合發揮抗炎免疫調節功用。丹參、川芎、赤芍等活血化瘀常用中藥可以從多種途徑[51，52]發揮作用，具體包括：①促使血流加速；②增加毛細血管網開放，并提高其張力；③改善微循環；④增強組織耐受缺氧及抗損傷的能力；⑤有效增加冠狀動脈流量；⑥通過調節NO/ET 平衡調節血管通透性；⑦通過抑制促炎因子（如CRP、TNF-α等）或促進抗炎因子（如IL-10等）表達從而綜合抗炎。圍繞冠心病血瘀證已先后開展多項活血化瘀療法的臨床研究，結果表明，以活血化瘀為組方原則，應用活血化瘀中藥進行治療，可以明顯改善冠心病心絞痛相關癥狀、緩解缺血、抑制炎癥反應，從而有效提高患者的生活質量[6]。有文獻指出，在冠心病患者血液中存在多種導致動脈硬化的抗體，而活血化瘀藥物不僅可以通過調整機體細胞免疫及淋巴免疫的功能而促進瘀血消散，而且可以通過減少炎癥因子的表達、抑制機體免疫作用等，從而降低內皮細胞通透性[53，54]。

以三七總皂苷為主要成分的血塞通軟膠囊，具有活血化瘀、通絡止痛之功效，可用于冠心病血瘀證治療中，不僅能有效改善患者心肌缺血癥狀及血流動力學指標，還可發揮調節免疫、抗炎，延緩動脈硬化的作用，從而保護損傷的血管內皮，其發揮作用可能與調控hsa-miR-199a-5b 和hsa-miR-146b-5p 及他們所調控的抗原遞呈通路存在一定的關系[55，56]。臨床試驗表明，均具活血化瘀功效的丹參及川芎合用可以增強藥效，據此研發的丹參川芎嗪注射液在臨床療效觀察中顯示，可以通過抑制炎癥反應，延緩動脈斑塊形成，增加冠脈的血流量，從而改善患者的臨床相關癥狀[57]。同樣具有活血化瘀、通絡止痛功效的銀丹通絡膠囊是由丹酚酸、三七總皂苷及銀杏提取物組成，主要應用于冠心病血瘀內阻證患者。一項基于90 例冠心病不穩定型心絞痛血瘀證患者的隨機對照臨床研究表明，銀丹通絡膠囊干預后患者血漿纖溶酶原激活劑抑制物（Plasminogen activator inhibitor，PAI）水平顯著下降，而該指標與C 反應蛋白相關，明確了該藥在改善患者臨床癥狀的同時，可以有效降低炎癥因子及相關標志物水平，提示其具有抗炎作用[58，59]。

4 小結

早期研究發現，冠心病血瘀證患者免疫炎癥臨床相關生物標志物表達水平存在差異，以此為切入點，研究者們試圖說明冠心病血瘀證與免疫炎癥過程存在相關性。然而，相關性只是因果邏輯關系的前提，若要進一步探尋冠心病血瘀證在免疫炎癥方面的具體機制，則需深入到細胞乃至分子水平。基于當前多組學技術、系統生物學及生物信息技術的發展，冠心病血瘀證研究層面已深入到DNA、RNA 及蛋白水平。盡管如此，由于免疫炎癥反應本身具有復雜性，免疫及炎癥相關信號在傳遞和發揮作用的過程中往往涉及多種免疫細胞和炎癥因子，機制表型層級嵌套豐富，不同研究層次之間往往同時存在關聯、交互與重疊，這些均會對全面清晰地闡述冠心病血瘀證的免疫炎癥機制造成一定的困難。當前，多數研究也僅從免疫炎癥中的某個單一角度對冠心病血瘀證機制進行探索，尚缺乏深入系統囊括免疫炎癥多重機制及環節的網絡研究，這也是構建冠心病血瘀證免疫炎癥完整機制的必要前提。在未來的研究中，我們可以先從間接機制入手，利用高通量測序及芯片等技術，對冠心病血瘀證患者使用中藥干預前后發生變化的免疫炎癥相關通路進行富集分析，并利用生物信息學多種在線數據庫及預測工具平臺，對可能涉及的免疫及炎癥分子進行預測，并利用成熟的技術手段實現通量降維，驗證并確定參與免疫炎癥過程的關鍵調控分子，從而篩選并構建冠心病血瘀證相關的免疫炎癥通路及生物標記物，最后再回溯到臨床進行轉化。

從發現冠心病血瘀證與免疫炎癥反應存在相關性，到二者間深層機制的探尋，我們經歷了“知其然”到“知其所以然”的過程。以中醫藥理論為指導，結合現代分子生物學等技術，是冠心病血瘀證實質研究的基礎，免疫炎癥作為其實質研究的一個分支，也受到了越來越多的關注。相信隨著技術的不斷發展，知識的不斷更新及新興科研方法的不斷建立，冠心病血瘀證在免疫炎癥層面的具體機制會逐漸清晰，結合活血化瘀中藥相關藥理作用，二者之間形成互相印證的閉環，這也有助于回答活血化瘀中藥為何能在冠心病血瘀證臨床治療過程中發揮療效。