分子生物學技術在飼料微生物檢測中的優勢

胡靖宜，王忠艷

（東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱 150040）

1 微生物檢測意義

近年來，飼料安全問題頻發，引起廣泛關注，飼料安全問題一般由致病菌引起。隨著社會的高速發展，分子生物學技術成果顯示強大優勢。人工模擬酶、催化劑，領導化學工業新革命。此外，分子生物學技術可應用到化學方面及飼料的微生物檢測，能夠保證飼料安全和人類健康。

通常情況下，在飼料的生產、加工、運輸過程中極易被微生物感染。通常在飼料中加入防腐劑、防霉劑，但保鮮效果不明顯。飼料一旦受到微生物污染營養價值就會降低，動物在食用霉變飼料后，易生病或死亡，造成經濟損失。

飼料安全問題備受關注，飼料檢測技術也日漸完善，飼料中不允許存在危害動物健康的細菌、真菌等。為了快速高效地檢測飼料中微生物的含量各國家的重大戰略問題[1]。

2 微生物檢測傳統方法

研究顯示，傳統方法培養微生物種類較少，約為環境中微生物含量1%，無法準確檢測飼料中微生物種類和數量。

目前，國內對飼料微生物檢測傳統方法有平板涂布法、血球記數板直接記數法、酶聯免疫吸附測定法等[2]。傳統微生物檢測方法在飼料的微生物檢測中存在以下幾點不足：

（1）準確性低：檢測飼料中微生物數量準確性不高，且種類有限；

（2）檢測時間長：由于樣品需要培養，通常需要數小時甚至幾天的檢測時間；

（3）易污染：傳統檢測方法需要樣品培養，流程相對復雜，對樣品的處理過程中易造成污染。

隨著科學技術不斷發展，分子生物學技術在微生物檢測領域顯示優勢，具有特異性強、速度快、無需樣品培養、污染小、精度高、檢測范圍廣以及試劑耗材相對較少且成本低的優點[3]。

3 飼料中微生物檢測

我國飼料微生物檢測細菌主要是大腸桿菌、霉菌及沙門氏菌。

大腸桿菌是糞便污染的指示菌，顯示飼料是否存在糞便污染。動物一旦食用被大腸桿菌污染飼料后，損傷腸道上皮細胞，且產生某種腸毒素。

霉菌是主要危害飼料微生物群，我國因飼料霉變而導致的經濟損失巨大。飼料被霉菌污染后會降低其營養價值，動物食用后免疫系統受到干擾，影響動物正常生長發育。沙門氏菌能夠感染多種動物宿主，具有侵襲性，大部分動物感染沙門氏菌后，容易引起動物傷寒、副傷寒及急性胃炎發生，排出黏性血便和水樣便。

相比傳統方法，分子生物學技術作為一種新型的檢測技術，以分子水平研究生物大分子的結構與功能，以基因序列多樣性為檢測原理，通過識別并標記飼料中相應分子，達到檢測飼料中微生物種類和含量目的。在飼料的微生物檢測中，主要采用PCR技術、基因探針技術和基因芯片技術。因飼料檢驗工作范圍大，分子生物學技術可高效、精準檢測飼料中微生物的種類和含量，所以，可將該技術應用于飼料的微生物檢測。

4 分子生物學技術主要檢測手段

4.1 PCR技術

PCR技術具有較強特異性和靈敏度、檢測速度快、準確性高。廣泛應用在食品微生物檢測各領域，逐步用于飼料微生物檢測。PCR技術是以一段DNA 作為模板，在DNA 聚合酶和核苷酸底物共同參與下，大量擴增該段DNA，檢測其擴增產物后進行分析。在飼料微生物檢測中，通過聚合酶反應，能夠檢測飼料微生物病原，得到飼料中致病菌含量。PCR技術特異性強，靈敏度高，能夠快速得出檢驗結果。

沙門氏菌是一種人畜常見的食源性致病菌，對動物危害很大。飼料衛生標準中規定，飼料中不可以存在沙門氏菌。目前，沙門氏菌檢測方法是前增菌、增菌、分離等步驟。操作復雜且耗時較長，無法滿足發展需要。GB/T 28642-2012《飼料中沙門氏菌的快速檢測方法聚合酶鏈式反應（PCR）法》于2012年第17 號發布，該標準規定飼料中沙門氏菌快速檢測的方法聚合酶鏈式反應（PCR）法，并于2012年11月起正式實施。這表明PCR技術將廣泛應用于沙門氏菌檢測。

隨著研究不斷深入，將在飼料沙門氏菌及其他致病菌的檢測中得到更多的應用[4-10]。

4.2 基因探針技術

該方法又被稱為核酸分子雜交法，為DNA 分析奠定良好基礎, 并得到相關領域認可。基因探針技術利用互補基因的特異性，能夠識別特異堿基序列中一段單鏈DNA 或者RNA 分子，然后再與靶細胞雜交，對雜交產物進行檢測，即可得到微生物含量。能夠快速靈敏地檢測到致病性微生物。工作人員對病原體進行分離或標記，制作探針，任何病原體都有核酸片段，利用有標記探針可進行雜交工作，如樣品中有特定病原體，要明確病原體中特定性，結合探針與核酸序列[5]，通過特殊方法測定標記物。

基因探針技術不但可以檢測特異RNA，還可以檢測任意一種微生物。由于其特異性強、靈敏度高等優勢獲得了學術領域的認可，但基因探針技術仍然存在一定的不足，成本較高，操作也比較繁瑣，還會對人體產生一定的危害，限制基因探針技術的發展。所以，需要進一步優化非放射性標記探針，將探針信號放大，研究簡單的雜交形式，使該方法更加簡單、便捷[6]。

4.3 基因芯片技術

目前，微生物檢測較為常見的技術就是基因芯片技術，基因芯片技術主要應用原理是雜交測序，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法。用熒光素進行標記，通過分析熒光分布確定檢測樣品中的特定微生物，有助于分析總結有害微生物的特征[11]。基因芯片能夠同時分析數萬個基因，進行高通量篩選與檢測分析，解決傳統核酸印跡雜交技術操作復雜、自動化程度低、檢測目的分子數量少等不足。

在對飼料中微生物檢測的過程中，主要通過對微生物檢驗中的基因序列識別，發現基因識別中存在問題并進行標記，通過序列變化識別飼料中微生物種類及含量。也可以通過基因序列變化判斷是否存在微生物超標，檢測控制飼料中微生物含量，保障飼料的安全[12]。

5 結 語

由此可見，分子生物學技術在飼料微生物的檢測中具有明顯的優勢，通過分子生物學高效、快速等優點，可有效提高飼料中微生物檢測效率進而改善飼料質量，提高飼料的安全性。

對飼料中微生物檢測的同時，還應將分子生物學技術應用細化，用不同技術檢測不同微生物種類，完善分子生物學技術的應用。