非編碼RNA在骨代謝及骨重建中作用的研究進展

黃竹 楊嵐 江千舟 郭呂華

廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，廣州口腔疾病研究所，廣州醫(yī)科大學口腔醫(yī)學重點實驗室（廣州510140）

隨著二代深度測序等新技術的不斷發(fā)展，研究發(fā)現大部分人類基因組被轉錄成RNA，但這其中只有不到2%的RNA序列進行蛋白質的編碼，剩余的大部分RNA序列并不參與蛋白質的編碼，被稱為非編碼 RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）［1］，這表明非編碼RNA占了RNA的絕大部分，了解其主要功能和作用機制才能更深入理解機體的病理生理狀態(tài)。非編碼RNA通過募集表觀遺傳調節(jié)因子或轉錄因子來激活或沉默轉錄過程，在細胞活動中發(fā)揮重要的調節(jié)作用［2］。ncRNAs廣泛參與機體的生長發(fā)育過程，并與各種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，而近年的研究發(fā)現，ncRNAs與骨改建、成骨分化以及骨代謝相關疾病密切相關［3-5］。了解非編碼RNA在骨代謝和骨修復重建中的作用機制，有助于探明骨相關疾病的發(fā)病機理，為骨相關疾病的臨床治療提供理論基礎。本文通過對幾種常見非編碼RNA調節(jié)相應骨細胞，促進成骨分化的相關研究進行綜述，闡明非編碼RNA在骨修復重建及骨相關疾病中的研究進展。

1 非編碼RNA家族

不編碼蛋白的RNA家族根據功能可分為兩大家族：管家非編碼RNA（housekeeping noncoding RNAs）和調控性非編碼RNA（regulatory noncoding RNAs）。其中管家非編碼RNA包括了轉運RNA（tRNAs），核糖體RNA（rRNAs）和胞質小RNA（small cytoplasmic RNAs，scRNAs）。管家 ncRNA 在轉錄翻譯的過程中多個環(huán)節(jié)起作用，是蛋白表達不可或缺的組成部分；而調控性非編碼RNA是隨著各種基因技術的發(fā)展才逐漸步入人們視線的新發(fā)現的RNA類型。大量的研究顯示這一類RNA在幾乎所有生物活動中發(fā)揮作用，是生物體RNA的重要組成部分。調控性非編碼RNA根據長度可分為兩類：分為短鏈非編碼RNA和長鏈非編碼RNA。其中短鏈非編碼RNA是由少于200核苷酸組成，主要包括小干擾RNA（small interfering RNAs），微小RNA（microRNAs，miRNAs）以及PIWI相互作用RNA（piRNAs），目前研究較為廣泛的是miRNAs。據估計，人類基因組編碼超過1 800種miRNAs。而長度＞200核苷酸的RNA成為長鏈非編碼RNA。近年來，還出現一種帶有環(huán)形結構的環(huán)狀RNA。微小RNA，長鏈非編碼RNA，和環(huán)狀RNA是目前研究較為廣泛的幾種ncRNAs。

1.1 微小 RNA（micro RNAs，miRNAs） 微小RNA是一類存在于所有真核細胞中，長度約為20～22核苷酸的莖環(huán)狀內源性小RNA，大多位于非編碼區(qū)內。miRNA通過結合序列互補配對信使RNA轉錄本的3′-UTR端，能有效降低靶基因的表達水平，負向調控蛋白的表達［6］。miRNA對蛋白的負向調控作用通過以下3種機制來實現：（1）RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）對互補區(qū)域的信使RNA進行切割和降解是其主要的作用機制；（2）與信使RNA結合和去穩(wěn)定化；（3）降低核糖體翻譯的效率［7］。人類基因組編碼著大約1 800種miRNAs，并且接近三分之二的編碼蛋白的基因擁有miRNA的結合位點［8］。miRNAs在骨的形成和代謝中發(fā)揮重要作用，如miR-21、miR-31、miR-155等miRNAs在破骨細胞形成或發(fā)揮作用過程中高表達而被廣泛研究［9］。

1.2 長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs） lncRNAs可分為5種，反義長非編碼RNA（antisense lncRNAs）、內含子非編碼 RNA（intronic transcriptlncRNAs）、lincRNA（large intergenic noncoding RNAs）、啟動子相關lncRNA（promoter-associated lncRNAs）、非非翻譯區(qū) lncRNA（UTR associated lncRNAs）。lncRNAs不直接參與蛋白的編碼，而是通過多種機制參與蛋白調控，如組蛋白修飾、DNA甲基化、染色質重構、作為競爭內源性RNA（ceRNA，competing endogenous RNA）、參與mRNA穩(wěn)定化和支架蛋白的募集等［5］。由于lncRNAs分子結構的靈活性，lncRNAs既能通過堿基互補配對結合RNA，又能形成二級結構甚至三級結構等多種折疊構象結合蛋白，影響轉錄和轉錄后的基因表達，使lncRNAs形成可調節(jié)DNA、RNA分子和蛋白復合體的廣泛調節(jié)網絡［10］。

1.3 環(huán)狀RNA（circular RNAs，circRNAs） 20世紀70年代末首次在真核細胞中發(fā)現circ RNA，它是一類廣泛存在于真核細胞內的非編碼RNA（Non-coding RNAs）。與常規(guī)線性RNA不同，環(huán)狀RNA以連續(xù)共價閉合環(huán)的特殊結構取代線性RNA分子3′-帽子結構以及5′-多聚核苷酸末端結構，使環(huán)狀RNA具有更高的穩(wěn)定性和保守性。隨著現代基因研究技術的發(fā)展，大量證據［11］表明circRNAs并非是錯誤剪接的產物，而是在生物體內發(fā)揮著重要的作用，并與人類疾病的發(fā)生發(fā)展有著緊密的關聯。環(huán)狀RNA通過調控基因的轉錄、翻譯、拼接等關鍵步驟介導多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。circRNAs主要的作用是其本身存在大量miRNA結合位點，可以通過“海綿吸附”機制誘捕miRNA，從而調節(jié)靶基因翻譯。此外，它可以作為調控因子在轉錄水平對親本基因進行調控，它還可以直接對蛋白進行調控，協調蛋白與蛋白之間的關系［11］。隨著研究的不斷深入，發(fā)現環(huán)狀RNA與骨相關疾病發(fā)生關系密切，如骨肉瘤的發(fā)生［12］。

2 非編碼RNA對骨代謝以及骨修復再生的影響

人體正常骨組織維持在一個動態(tài)平衡中，骨重建是一個終身的過程，是新骨組織形成和成熟骨組織再吸收之間動態(tài)平衡的過程［13］。成骨和破骨兩個過程不斷進行，并達到一定的平衡和穩(wěn)定。ncRNAs作為人類基因組的大部組成部分，在胚胎骨骼發(fā)育以及成熟骨組織種都發(fā)揮重要作用，影響著骨骼內外各種相關細胞的生長、分化以及凋亡等各項生理活動［4-5，14］。

2.1 ncRNAs對成骨細胞（osteoblast）破骨細胞（osteoclast）的作用 目前已有多個研究證明多種ncRNAs在成骨分化過程中起著重要的調節(jié)作用。成骨細胞是來自間充質干細胞（MSC）系的分化細胞。CHONG等［15］通過對MACF1沉默的前成骨細胞測序分析篩選得到lncRNA AK016739，并證明lncRNA AK016739通過抑制轉錄因子RUNX2和TCF7/LEF1來抑制骨的成骨細胞分化和骨的生成。QIAN等［16］用BMP2處理過的MC3T3-E1細胞，158個環(huán)狀RNA的表達發(fā)生改變，其中有74個上調和84個下調，其中hsa_circ_0005846、hsa_circ_0019142和hsa_circ_0010042顯著上調。破骨細胞來源于由多能造血干細胞產生的單核-巨噬細胞前體細胞，主要介導骨組織的吸收。破骨細胞在形成過程中，多個miRNAs發(fā)揮作用，其中miRNA-21是迄今為止鑒定最為廣泛的促破骨細胞生成的miRNA 之一［17］。CAI等［18］通過將載 miR-214沉默抑制劑的納米材料，凍干后溶解靜脈注射入卵巢摘除小鼠體內，發(fā)現骨吸收程度較陰性對照組降低，經證實是miR-214通過減弱破骨細胞的活動起作用。

2.2 ncRNAs對骨髓間充質干細胞（BMSCs）的作用 骨髓間充質干細胞（bone-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是一類具有多向分化潛能的細胞，在骨組織工程中起著重要的作用。研究表明在骨修復重建過程中，BMSCs的多種ncRNAs會發(fā)生不同程度的改變。ZHANG等［19］對成骨誘導分化處理后的hBMSCs進行編碼和非編碼轉錄本表達的功能網絡分析和生物信息學分析，發(fā)現了6種核心的調控 lncRNAs（XR_111050、NR_024031、FR374455、FR401275、ER406817和 FR148647），并且進一步驗證lncRNA（XR_111050）可增強MSCs的成骨分化。REN等［20］通過CGRP刺激小鼠BMSCs細胞進行成骨誘導處理后進行基因芯片測序發(fā)現58個差異表達的circRNAs，其中44個下調，14個上調并驗證mmu_circRNA_003795在成骨誘導過程中顯著上調，說明環(huán)狀RNA在BMSCs在成骨分化過程中發(fā)揮重要的作用。XIAO等［21］的實驗研究結果表明，miR-483-3p通過靶向STAT1來增強RUNX2的轉錄活性，從而促進BMSCs的成骨分化，由此確定miR-483-3p在成骨誘導中的作用，并提示miR-483-3p為治療骨質疏松癥的新型潛在治療靶標。

2.3 ncRNAs對牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）的作用 PDLSCs具有自我更新能力以及多向分化潛能，特別是成骨向分化潛能。LIU等［22］使用R語言篩選出人的牙周炎牙周膜組織與健康牙周膜組織之間差異表達的lncRNAs和mRNAs。結果顯示，與健康樣本相比，牙周炎樣品中的LncRNA MEG3和LncRNA IGF1的表達降低，而miR-27a-3p的表達則升高。實驗證明過表達MEG3可升高IGF1的表達從而抑制miRNA-27a-3p來促進成骨分化。ALP和ARS染色的結果表明，lncRNA MEG3或IGF1的上調促進了PDLSCs的成骨分化，而miRNA-27a-3p的上調則可以抑制成骨。在牙周炎患者中，MEG3的表達下調并通過miR-27a3p/IGF軸抑制了PDLSCs的成骨分化。另外，通過微陣列分析發(fā)現，miRNAs也參與到PDLSCs成骨向分化的過程中［23］。

3 非編碼RNA與骨相關疾病的關系

臨床上，正常的骨結構處于由成骨過程和破骨過程相協調的動態(tài)平衡過程，一旦這個平衡被打破，就引起一系列的骨相關疾病等病理現象。骨關節(jié)炎、牙周炎、骨質疏松等被認為是與骨破壞相關的疾病。ncRNAs與這些骨相關疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［4-5，14］。

3.1 骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA） OA是以關節(jié)軟骨的退變及損傷為病理特征的慢性疾病，其病理特點為關節(jié)軟骨磨損退變，關節(jié)邊緣和軟骨下骨反應性增生，骨贅形成。臨床表現為膝關節(jié)功能異常。XING等［24］骨關節(jié)病組織與正常組織相比，有121個IncRNA表達異常，其中上調的73個，下調的48個。六種 lncRNAs（HOTAIR，GAS5，PMS2L2，RP11-445H22.4，H19和CTD-2574D22.4）的表達在OA軟骨中上調，可能是通過增加MMP-9，MMP-13，BMP-2和ADAMTS5表達來調節(jié)的。IncRNAs可以通過甲基化或乙酰化對組蛋白進行修飾，進而調節(jié)基因的轉錄活性。若充分利用IncRNAs的表觀遺傳干預能力，可進行基因的靶向治療，甚至可能研發(fā)出一些靶向治療的藥物。

3.2 骨質疏松 骨質疏松（osteoporosis）是隨著年齡增大，人群發(fā)病率增高，以皮質骨變薄，微結構受損，骨小梁數量下降為特征，使骨骼易患骨脆性和骨折的風險增高的一種全身骨代謝障礙性疾病［24］。許多研究證明骨質疏松與miRNAs調節(jié)有關。最近的研究表明，在骨質疏松性骨折患者的血清中有幾種miRNA的表達顯著上調，并且可以影響成骨分化［17］。CHENG 等［25］檢測骨質疏松患者的血清發(fā)現miRNA-365a-3p的表達顯著升高，通過預測網站miRanda預測并進行雙熒光素酶報告基因實驗驗證了miRNA-365a-3與靶基因RUNX2的結合，下調miRNA-365a-3的表達能顯著降低成骨相關基因（OCN、OPN、collagen I）的表達。LI等［26］在絕經后骨質疏松癥患者的血清中檢測到miR-133a上調，這個結果與患者的腰骨礦物質密度（BMD）呈負相關。經證明，在體外敲除miR-133a可以抑制RANKL誘導的破骨細胞生成，在體內可以減輕去卵巢大鼠的骨質流失。目前有關骨質疏松的基因研究，大部分聚焦于miRNAs，而lncRNAs和circRNAs在骨質疏松這方面的研究目前較少［27-28］。越來越多的證據表明miRNAs在調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用。

3.3 骨肉瘤 在骨腫瘤發(fā)生和發(fā)展中circRNAs的表達水平失調已被證實扮演著極為重要的角色［29］。研究發(fā)現在人骨肉瘤組織中circUBAP2的表達顯著升高，并證實其是通過抑制miR-143的表達，上調Bcl-2的表達水平，提示circUBAP2在骨肉瘤的診斷治療和預后預測存在巨大潛力［30］。lncRNAs在骨肉瘤中也差異表達。有研究證明在骨肉瘤組織中，MiR-200s表達下調，與骨肉瘤組織中的lncRNA ZEB1-AS1和靶基因ZEB1表達水平負相關，上調lncRNA ZEB1-AS1可海綿吸附MiR-200s，從而使ZEB1表達水平上調。lncRNA ZEB1-AS1下調和miR-200s過表達的組合顯著抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移［31］。circRNAs和lncRNAs在骨肉瘤中通過miRNAs發(fā)揮作用，對于骨肉瘤疾病的診斷及預后預測都有著重要的影響。

3.4 牙周炎 牙周炎是多因素引起的牙周組織進行性喪失的慢性疾病，除了微生物的作用，也可通過基因和表觀遺傳學因素調節(jié)牙周病原體誘導的宿主炎癥反應來影響牙周炎的進展［32］。LI等［33］利用生物信息學分析的方法對多個牙周炎樣本測序芯片數據結果進行分析發(fā)現，6個信使RNA（mRNAs）（HSPA4L、PANK3、YOD1、CTNNBIP1、EVI2B、ITGAL），3個 miRNAs（hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-200a、hsa-miR-142-3p）和 3個 lncRNAs（MALAT1、TUG1、FGD5-AS1）可能參與到牙周炎發(fā)病過程與lncRNA相關的內源性競爭網絡中。WANG等［34］對牙周炎患者與健康人的血液樣本進行檢測發(fā)現，牙周炎患者在治療前l(fā)ncRNA AWPPH在血液中的表達水平明顯高于健康人，在接受治療后，lncRNA AWPPH表達水平降低。在對這些患者進行跟蹤隨訪的時候，發(fā)現lncRNA AWPPH的水平與牙周炎復發(fā)情況呈正相關關系，高表達水平的lncRNA AWPPH可預測牙周炎的復發(fā)。牙周炎的發(fā)生發(fā)展與lncRNAs的調控有關。

4 總結與展望

非編碼RNA是人體內重要的調控分子，在機體的病理生理狀態(tài)發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。目前骨關聯疾病的病因和發(fā)病機制尚未闡明。在健康成熟的機體中，骨組織不斷進行的骨改建是在破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成處于動態(tài)平衡中進行的，一旦這個平衡被破壞，就會引起病理性骨的動態(tài)改建，而非編碼RNA在這個過程中扮演重要角色。

其中，相比于lncRNAs和circRNAs的海綿吸附作用間接調控靶基因，miRNAs對于靶基因的調控更為直接。miRNAs通過其特異性靶點和靶點介導的下游通路發(fā)揮作用。不同的miRNAs針對不同的基因。同一miRNA調控的靶基因往往因細胞和組織類型的不同而不同。即使在相同的細胞類型中，相同的miRNA目標靶點在不同的應激或疾病環(huán)境下也可能不同，這可能是由于不同條件下的基因表達和調控譜不同造成的。這說明miRNAs靶向基因調控具有高度特異性，對環(huán)境變化十分敏感。因此，在研究miRNAs在骨代謝疾病中的作用時，可針對不同人群、環(huán)境等條件對疾病加以區(qū)分研究。此外，同樣的生物過程，如破骨細胞分化，可以由多個miRNAs調控，其功能可能相互疊加，也可能相互補償。由此可見，在骨相關代謝疾病臨床前開發(fā)和臨床試驗中，考慮特定miRNA靶向不同靶點的潛在副作用是非常重要的。

另一方面，在成骨相關研究中，circRNAs、lncRNAs研究較多的是它們的海綿吸附作用，它們能夠隔離miRNA并阻止其與mRNA靶點的結合。這些都增加了骨重建、骨代謝過程中基因調控的復雜性。盡管有研究表明它們還可以通過對靶基因的直接調控起作用，如circRNAs可作為內部核糖體進入位點的序列來促進起始因子或核糖體與可翻譯的circRNA直接結合［35］。但目前在成骨機制研究方面，circRNAs及l(fā)ncRNAs直接調控靶基因的研究尚不充分［36］，因此，后續(xù)研究可以從這方面深入。

在促進成骨的環(huán)境或破骨的環(huán)境中，對于miRNA-mRNA和miRNA-ceRNA甚至是lncRNA-mRNA或circRNA-mRNA網絡的理解，對于有關非編碼RNA在骨代謝及骨再生相關調控機制的研究將有助于臨床上多種骨關聯疾病的發(fā)生發(fā)展機制的研究。由于miRNA分子靶向基因對環(huán)境敏感的特異性，以及ceRNA網絡的多樣性，增加了機制研究的復雜性，但也為研究提供了更多的機會與可能，為骨關聯疾病治療提供了方向。