小麥中嘔吐毒素的ELISA和HPLC法檢測分析

馬曉靜

摘? ? 要：小麥?zhǔn)羌Z食作物的一種，小麥的質(zhì)量直接影響著其銷量，且關(guān)乎人體健康。小麥中的嘔吐毒素含量一旦超標(biāo)，相關(guān)制造業(yè)運營的穩(wěn)定性則難以保證，導(dǎo)致企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益不同程度受損。基于此，應(yīng)用ELISA和HPLC法檢測小麥嘔吐毒素的含量，既能了解不同檢測方法的應(yīng)用原理，又能全面保證小麥質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：小麥;嘔吐毒素;ELISA法;HPLC法;檢測分析

文章編號： 1005-2690（2020）21-0019-02? ? ? ?中圖分類號： R446.6? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

我國河北省的小麥產(chǎn)量逐年增多，使用ELISA法和HPLC法準(zhǔn)確檢測小麥嘔吐毒素的含量，將檢測結(jié)果作為衡量小麥質(zhì)量、篩選合規(guī)小麥的重要標(biāo)準(zhǔn)，以此提升河北省的小麥銷量，盡可能降低小麥加工企業(yè)的安全風(fēng)險。從糧食安全保障角度出發(fā)，分析ELISA法和HPLC法在小麥嘔吐毒素檢測中的應(yīng)用十分必要，能夠在一定程度上減輕儲糧經(jīng)濟(jì)損失。

1? ?嘔吐毒素

嘔吐霉素指主成分為DON的單端孢霉烯族化合物[1]，在禾谷鐮刀菌、粉紅鐮刀菌作用下生成，因為嘔吐霉素中DON結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、毒害性較大，一旦谷物中出現(xiàn)嘔吐毒素且含量超過規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，那么谷物產(chǎn)品及其加工品的安全風(fēng)險會大大增加。當(dāng)前，嘔吐毒素常見于小麥、高粱等糧食作物中，經(jīng)檢測可知嘔吐毒素的含量，應(yīng)據(jù)此制定可行的管控方法，盡可能減少食品安全問題的發(fā)生[2]。

2? ?小麥中嘔吐毒素檢測的常用方法

2.1? ?ELISA法

ELISA法的全稱為酶聯(lián)免疫檢測法，這種方法具有操作便捷、快速檢測等優(yōu)點，在小麥嘔吐毒素檢測中的適用性較強(qiáng)[3]。

酶聯(lián)免疫檢測試劑盒作為小麥樣品容納裝置，在酶標(biāo)板孔上預(yù)包被嘔吐毒素抗原，樣本中的嘔吐毒素和微孔上預(yù)包被抗原競爭嘔吐毒素抗體（抗試劑），同時嘔吐毒素抗體與酶標(biāo)記二抗（酶標(biāo)物）相結(jié)合經(jīng)TMB底物液顯色。

檢測期間，先后加入標(biāo)準(zhǔn)試劑或樣本、酶標(biāo)物、抗試劑，通過孵育結(jié)合、洗板等過程，隨后添加適量反應(yīng)物，然后加入顯色劑，根據(jù)藍(lán)色深度的不同，得知嘔吐霉素的含量。一般來說，嘔吐毒素含量由低到高，顏色會呈現(xiàn)出由藍(lán)到黃，顏色淺黃代表嘔吐霉素含量超標(biāo)。最后加入終止液令反應(yīng)停止，直到物質(zhì)顏色變黃。接下來使用酶標(biāo)儀檢測污染程度，樣本的吸光度值與其嘔吐毒素含量負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，再乘以稀釋倍數(shù)，即可得到嘔吐霉素的含量，用以提示工作人員采取相應(yīng)的管控措施。酶聯(lián)免疫檢測法的缺點是檢測環(huán)節(jié)需要嚴(yán)控溫濕度，并且檢測結(jié)果存在一定誤差。

2.2? ?HPLC法

HPLC法全稱為高效液相色譜法，用這一方法檢測小麥中的嘔吐毒素含量時，應(yīng)做好準(zhǔn)備工作以減少檢測誤差，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和全面性[4]。但該檢測法具有耗時長、成本高等缺點，所以檢測機(jī)構(gòu)要慎重選用高效液相色譜法。當(dāng)提出高精度檢測要求時，高效液相色譜法更為適宜。

3? ?采用ELISA法或HPLC法檢測小麥嘔吐毒素

3.1? ?材料及設(shè)備

嘔吐霉素標(biāo)準(zhǔn)液為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（100? μg/mL）;嘔吐毒素免疫親和柱由北京華安麥科有限公司生產(chǎn);紫外檢測器的型號為Agilent;電子天平的型號為METTLERME;嘔吐毒素測試盒的型號為ELISA，產(chǎn)自北京華安麥科有限公司;酶標(biāo)儀型號為680，由BIO-RAD企業(yè)生產(chǎn);高效液相色譜儀來自Agilent企業(yè);糧食測試粉碎磨的型號為JSFM-Ⅱ，來自中儲糧成都儲藏研究院，旋渦混合器的型號為WH-861，來自上海驥輝企業(yè)。

3.2? ?檢測方法

3.2.1? ?ELISA法檢測小麥中嘔吐毒素的步驟

ELISA測試盒存放于冰箱低溫環(huán)境，用其檢測小麥嘔吐霉素時，由低溫環(huán)境轉(zhuǎn)移到室溫環(huán)境，平衡1 h以上，反應(yīng)溫度控制在20～25 ℃。為了直觀觀察顏色變化，在反應(yīng)板上妥善放置酶標(biāo)板微孔，并做好微孔標(biāo)記工作。接下來，在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中分別加入DON標(biāo)準(zhǔn)溶液和過濾并稀釋好的樣品提取液，均為50 μL，逐孔加入50 μL酶標(biāo)物、50 μL抗試劑，輕輕震蕩混勻，蓋板膜蓋好后，置于25 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min，小心揭開蓋膜將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250 μL/孔充分洗滌4～5次，每次間隔10 s，在吸水紙上拍干，然后逐孔加入100 μL底物液，蓋板膜蓋好后置于25 ℃的避光環(huán)境中5 min，取出逐孔加入50 μL終止液，輕輕震蕩混勻，在BIO-RAD680酶標(biāo)儀上測量其吸光度（450 nm/630 nm）。

3.2.2? ?HPLC法檢測小麥中嘔吐毒素的步驟

色譜柱為C18柱（4.6 mm×150 nm，5 μm）;柱溫35 ℃，流動速度為0.8 mL/min;流動相為甲醇（體積比20）、水（體積比80）;檢測波長218 nm;進(jìn)樣體積為50 μL。

預(yù)處理：將小麥樣品均勻混合，用電子天平稱取25.00 g，放置在錐形容器中（刻度為250 mL），然后分別添加不同規(guī)格的標(biāo)準(zhǔn)溶液至0.8 μg/g、1.2 μg/g、3.2 μg/g，之后加入100 mL水，均勻混合后震蕩20 min（220 r/min），提取適量并離心5 min，取上清液，接下來用玻璃纖維濾紙過濾，將免疫親和柱連接于玻璃注射器，與壓力泵連接，分別吸取上述濾液2.0 mL，以1滴/s速度流通親和柱，在空氣進(jìn)入親和柱之后停止，將流出液去除，并用水5 mL對親和柱進(jìn)行淋洗2次，流速為2滴/s，在空氣進(jìn)入親和柱之后停止，同時將流出液去除，滴加甲醇2.0 mL，同時以1滴/s流速進(jìn)行洗脫處理，對所有洗脫液進(jìn)行收集。在50 ℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干，加入1.0 mL流動相溶解殘留物，渦旋30 s，過濾膜濾進(jìn)樣瓶中。

經(jīng)線性關(guān)系分析可知，用20%甲醇-水將嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（10μg/mL）配制工作液，最佳線性關(guān)系中嘔吐毒素濃度為0.05～4.00 μg /mL。

3.3? ?結(jié)果及分析

3.3.1? ?ELISA法檢測結(jié)果

取不含嘔吐毒素的小麥樣品，分別添加水平為0.8 μg/g和3.2 μg/g的標(biāo)準(zhǔn)品，降解酶DON含量為0.8 μg/g時，降解率75.86%;降解酶DON含量為3.2 μg/g時，降解率約92.57%。降解酶活力受酶濃度、溫度兩個因素影響，酶濃度45μg /mL之前降解率直線提高，酶濃度超過45μg/mL后，飽和后降解率趨于平緩。反應(yīng)溫度25 ℃時降解率最高。此外，酶活力強(qiáng)弱通過酶作用時長來檢驗，25 ℃時小麥中DON被高效降解，當(dāng)反應(yīng)時間延長，DON的降解率再次提高;反應(yīng)至20 min后，降解率平穩(wěn)變化。當(dāng)酸堿度變化時，DON降解情況隨之改變，反應(yīng)溫度小于25 ℃且酸堿值<8，當(dāng)酸堿度增加，則DON降解率提高;酸堿值>8后酸堿度增加，DON降解幅度減小。

3.3.2? ?HPLC法檢測結(jié)果

為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實性，進(jìn)行精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收試驗。

測定精密度時標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4 μg/mL，進(jìn)樣持續(xù)5次，記錄峰面積，得知嘔吐毒素相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.35%，精密度良好;測定重復(fù)性時，取一式五份平行樣品，參照供試品溶液制備方式測試峰面積，得知嘔吐毒素相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.55%，重復(fù)性較佳;測定穩(wěn)定性時取相同樣品溶液，在2 d內(nèi)每間隔3 h進(jìn)樣分析，并對比峰面積變化情況，嘔吐毒素相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%，穩(wěn)定性良好;測定回收試驗時小麥取樣量25.00 g，對應(yīng)加入量1.000 μg/g、測定量0.998 μg/g、回收率91.704%;小麥另一份取樣量同為25.00 g時，對應(yīng)加入量1.000 μg/g、測定量977.45 μg/g、回收率92.037%。嘔吐毒素相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.17%。

3.3.3? ?ELISA法與HPLC法對比

基于加標(biāo)回收試驗，了解這兩種測試方法在小麥嘔吐毒素檢測中的應(yīng)用情況，其中，ELISA法程序簡單，過濾后能夠直接檢測，回收率在75%～125%之間。相對來講，HPLC法的檢測步驟煩瑣，經(jīng)過免疫親和柱處理及長時間得到檢測結(jié)果，回收率在70%～90%之間。當(dāng)加標(biāo)濃度同時增加，二者差異甚微。間接反映出ELISA測試盒具有實用性，其檢測結(jié)果可供參考。

對于小麥嘔吐毒素檢測工作者來說，應(yīng)客觀掌握這兩種檢測方法的應(yīng)用原理及優(yōu)缺點，了解二者的異同之處，以便合理選擇檢測法，快速、準(zhǔn)確得出檢測數(shù)據(jù)，確保小麥質(zhì)控措施的有效制定[5]。例如，針對大量小麥樣品快速篩選時，ELISA法更具適用性，因為這一方法易操作、靈敏度高、等待結(jié)果的時間短;針對少量小麥樣品質(zhì)量高精度檢測時，選擇HPLC法更為適宜，其檢測結(jié)果誤差較小，能為后續(xù)質(zhì)控實踐指明方向。必要情況下，聯(lián)合應(yīng)用ELISA法和HPLC法，既能彌補單一檢測方法的不足之處，又能得出可靠的檢測結(jié)果。

4? ?結(jié)論

綜上所述，小麥嘔吐毒素測定工作的重要性日益突顯，為準(zhǔn)確獲取小麥中的嘔吐毒素含量，視情況選用ELISA法或HPLC法，既能彌補傳統(tǒng)檢測方法的不足，又能真實、準(zhǔn)確地測定嘔吐毒素濃度，對小麥產(chǎn)品及其加工品的質(zhì)量優(yōu)化以及保障糧食安全方面有很好的促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 單曉雪，楊娟，廖子龍.二氧化鈦光催化對小麥嘔吐毒素降解效果的研究[J].化學(xué)試劑，2020，42（9）：1088-1092.

[ 2 ] 何苗，李鑫.高效液相色譜法測定浮小麥中的嘔吐毒素[J].海峽藥學(xué)，2020，32（2）：36-38.

[ 3 ] 鞏性濤，王培，宋永泉.小麥中嘔吐毒素的分布規(guī)律及加工影響[J].糧食加工，2020，45（1）：27-29.

[ 4 ] 姜冬梅，王荷，武琳霞.小麥中嘔吐毒素研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2020，11（2）：423-432.

[ 5 ] 戴木香，顏楹.小麥入庫快速檢測嘔吐毒素的方法[J].糧油倉儲科技通訊，2019，35（3）：41-42.