基于HPLC法和多元統計分析的不同產地香附揮發油中4種成分含量的比較研究

許娜 牟玉偵 李文兵 傅超美 陳胡蘭 王世宇 盧君蓉

摘 要 目的：建立同時測定香附揮發油中香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、馬兜鈴酮含量的方法，并比較不同產地香附樣品中4種成分的含量差異，為該藥材的種質篩選和開發利用提供參考。方法：以12個產地共46批香附為樣品，提取揮發油后，采用高效液相色譜法（HPLC）測定揮發油中香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、馬兜鈴酮含量。色譜柱為Kromasil C18，流動相為甲醇-水（68 ∶ 32，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為242 nm，進樣量為20 μL。以上述4個成分的含量為評價指標，通過雷達圖分析、聚類熱圖分析和主成分分析等多元統計分析，比較不同產地香附樣品的質量。結果：含量測定方法學考察結果均符合相關要求;不同產地香附揮發油中4種成分的總含量范圍為136.986 4～538.832 1 mg/g，其中以云南產樣品的總含量最高（平均值為476.059 2 mg/g）。雷達圖分析結果顯示，廣東、江西、廣西、云南4個產地樣品的整體輪廓較大、分布平衡度較好，其中以云南產樣品的整體輪廓最大、分布平衡度最好;聚類熱圖分析結果顯示，12個產地樣品可聚成兩大類，即產地為湖北、江西、云南、四川、廣東、山東、河南、陜西的樣品聚為第Ⅰ類，產地為廣西、山西、安徽、海南的樣品聚為第Ⅱ類，且第Ⅰ類產地樣品的質量優于第Ⅱ類;主成分分析結果顯示，前3個主成分的累計貢獻率為96.1%，12個產地樣品主要聚為兩大類，與聚類熱圖分析結果一致。結論：本研究所建HPLC法可用于香附揮發油中香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮和馬兜鈴酮含量的同時測定;12個產地樣品中以云南產香附的質量更優。

關鍵詞 香附;產地;揮發油;含量測定;高效液相色譜法;雷達圖分析;聚類熱圖分析;主成分分析

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of the contents of cyperotundone， nootkatone， α-cyperone and aristolone in the volatile oil of Cyperus rotundus， compare the content differences of 4 components in C. rotundus samples from different origins， and to provide reference for germplasm screening， development and utilization of the medicinal material. METHODS： The volatile oil was extracted from 46 batches of C. rotundus from 12 origins. The contents of cypermenone， nootkatone， α-cyperone and aristolone in volatile oil were determined by HPLC. The determination was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of methanol-water （68 ∶ 32， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min; the column temperature was 30 ℃; the detection wavelength was set at 242 nm; the sample size was 20 μL. Using the contents of above 4 components as evaluation indexes， radar image analysis， cluster thermal map analysis and principal component analysis were performed for comparing the quality of C. rotundus from different origins. RESULTS： The results of content determination methodology investigation met relevant requirements; the total contents of 4 components in volatile oil from C. rotundus from different origins ranged from 136.986 4 to 538.832 1 mg/g， of which the total content of samples from Yunnan was the highest （the average value was 476.059 2 mg/g）. Radar image analysis results showed that the whole contour in the 4 origins of Guangdong， Jiangxi， Guangxi and Yunnan was large relatively and better balanced， among which the samples from Yunnan had the largest overall contour and the best balance. The cluster thermal map analysis results showed that the samples from 12 origins could be grouped into 2 categories， the first category was from Hubei， Jiangxi， Yunnan， Sichuan， Guangdong， Shandong， Henan and Shaanxi; the second category was from Guangxi， Shanxi， Anhui and Hainan; the quality of samples from the first category were better than that of samples from the second category. The principal component analysis results showed that the cumulative contribution rate of the first three principal components was 96.1%， and the samples from 12 origins were mainly clustered into two categories， which was consistent with the results of cluster thermal map analysis. CONCLUSIONS： Established HPLC method can be used for simultaneous determination of ?cypermenone， nootkatone， α-cyperone and aristolone in volatile oil of C. rotundus from different origins. Among the samples from 12 origins， the quality of medicinal material from Yunnan is better.

2.2.5 精密度試驗 取香附揮發油（樣品編號：GX-1）適量，按“2.2.1（2）”方法制備供試品溶液，然后按“2.2.2”項下色譜條件重復進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、馬兜鈴酮峰面積的RSD分別為0.57%、0.56%、0.76%、1.64%（n=6），說明該方法精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取供試品溶液（樣品編號：GX-1）適量，分別在室溫條件下放置0、2、4、6、8、12、24 h后，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、馬兜鈴酮峰面積的RSD分別為0.59%、0.53%、0.69%、1.60%（n=7），表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取香附揮發油（樣品編號：GX-1）適量，共6份，分別按“2.2.1（2）”項下方法制成供試品溶液，然后按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并根據標準曲線計算各成分的含量。結果，香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、馬兜鈴酮含量的RSD分別為1.06%、1.92%、1.80%、1.65%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的香附揮發油（樣品編號：GX-1）3 mg，共6份，均按“2.2.1（2）”項下方法制備成供試品溶液，然后分別按與已知成分含量約1 ∶ 1（m/m）的比例精密加入各對照品溶液（均以甲醇為溶劑制備）適量，然后按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，根據標準曲線方程計算出各成分的含量并計算其加樣回收率。結果顯示，香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、馬兜鈴酮的平均加樣回收率分別為95.54%、100.57%、99.23%、96.86%，RSD分別為1.28%、2.34%、0.68%、1.75%（n=6），表明該方法準確度良好，結果見表4。

2.2.9 耐用性試驗 取香附揮發油（樣品編號：GX-1）適量，共3份，分別按“2.2.1（2）”項下方法制成供試品溶液，保持“2.2.2”項下其他色譜條件不變的情況下，分別考察其在不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25 、30 、35 ℃）、不同檢測波長（242、254、280 nm）條件下的測定結果，記錄峰面積，并根據標準曲線方程計算出各成分的含量。平行3次試驗，取平均值。結果，香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、馬兜鈴酮在不同流速下測得的含量的RSD分別為0.53%、0.88%、0.34%、0.77%（n=3）;在不同柱溫下測得的含量的RSD分別為0.33%、0.34%、1.28%、0.39%（n=3）;在不同檢測波長下測得的含量的RSD分別為0.35%、0.49%、0.68%、0.72%（n=3）。在3種條件下4種成分含量的RSD均小于3%，表明該方法耐用性良好。

2.2.10 樣品含量測定 取46批香附揮發油樣品適量，分別按“2.2.1（2）”項下方法制備成供試品溶液，然后按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并根據標準曲線計算出各成分的含量。結果，不同產地香附揮發油中4種成分的含量范圍跨度較大。香附烯酮的含量范圍為65.785 3～417.977 0 mg/g，其中以云南產香附揮發油中含量最高（平均值為315.159 6 mg/g）;圓柚桐的含量范圍為0.049 3～16.042 6 mg/g（除未檢出外），其中以廣東產香附揮發油中含量最高（平均值為5.853 9 mg/g）;α-香附酮的含量范圍為0.935 3～181.615 6 mg/g，其中以陜西產香附揮發油中含量最高（平均值為142.251 6 ? mg/g）;馬兜鈴酮的含量范圍為6.563 4～112.485 5 mg/g，其中以山西產香附揮發油中含量最高（平均值為95.002 6 mg/g）。不同產地香附揮發油中4種成分的總含量范圍為136.986 4～538.832 1 mg/g，其中以云南產香附揮發油中總含量最高（平均值為476.059 2 mg/g），結果見表5。

2.3 多元統計分析

為了進一步了解不同產地香附揮發油中4種成分的含量差異，本研究分別采用雷達圖分析、聚類熱圖分析和主成分分析對12個產地共46批香附樣品進行分析。

2.3.1 雷達圖分析 以香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、馬兜鈴酮含量為質量評價因子，采用Excel 2010版軟件繪制46批香附樣品的雷達圖，通過比較其輪廓大小以及各成分平衡分布情況來反映不同產地香附樣品的質量差異[28-29]，結果見圖2。結果顯示，以廣東、江西、廣西、云南產香附揮發油中4種成分的輪廓較大且分布平衡度較好，其中又以云南產香附的整體輪廓最大、分布平衡度最好，提示云南產香附樣品質量較好。

2.3.2 聚類熱圖分析 以香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、馬兜鈴酮4種成分的含量為評價指標，采用Heml-1.0軟件對46批香附樣品進行聚類熱圖分析。聚類熱圖縱向聚類結果反映不同產地樣品的含量差異關系，橫向聚類結果反映4種成分的含量差異關系，熱圖顏色深淺反映各成分含量的高低（顏色由淺到深代表含量由低到高）[30-32]，結果見圖3。產地聚類分析結果顯示，除編號為GD-9、GD-10、GD-11、GX-1、GX-3的5批樣品分布較為分散外，其余41批樣品按產地可聚為兩大類，即產地為湖北、江西、云南、四川、廣東、山東、河南、陜西的樣品聚為第Ⅰ類，產地為廣西、山西、安徽、海南的樣品聚為第Ⅱ類。成分聚類分析結果顯示，香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮這3個成分聚為一類，馬兜鈴酮單獨聚為另一類，表明香附烯酮、圓柚酮、馬兜鈴酮是區分不同產地樣品質量的差異性成分。比較圖3 中12個產地樣品的香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮條帶顏色，第Ⅰ類產地樣品整體條帶顏色偏深，第Ⅱ類產地樣品整體顏色相對較淺，這提示第Ⅰ類產地樣品質量較Ⅱ類產地樣品更好。

2.3.3 主成分分析 以香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮、馬兜鈴酮等4個主要成分含量為變量，采用SIMCA-P 14.1統計軟件對不同產地的46批樣品進行主成分分析。結果顯示，前3個主成分的累計貢獻率為96.1%，說明提取的3個主成分可以反映主要成分含量的大部分信息，主成分得分圖見圖4。結果顯示，同種形狀的樣品聚在一起（一種形狀代表一個產地），這與聚類熱圖中產地聚類結果基本一致，即主要聚為兩大類（編號為GD-9、GD-10、GD-11、GX-1、GX-3、JX-1、JX-2的樣品除外）：產地為湖北、江西、云南、四川、廣東、山東、河南、陜西的樣品聚為第Ⅰ類，產地為廣西、山西、安徽、海南的樣品聚為第Ⅱ類。主成分分析結果與熱圖聚類分析結果相互印證，進一步說明聚類熱圖的分類結果可靠。

3 討論

以往文獻研究發現，香附烯酮、α-香附酮、圓柚酮是香附中的主要活性成分，具有抗氧化、鎮痛、促進胃腸動力以及雌激素樣等作用，是香附及其炮制品含量測定比較常用的的指標成分[11-13]。為了進一步了解香附揮發油中主要活性成分有哪些，本課題組首先選用了多種對照品對色譜圖中含量較高的色譜峰進行定位，結果發現除了香附烯酮、α-香附酮、圓柚酮外，馬兜鈴酮在香附揮發油中的含量也較高，且廣泛分布在各批樣品中。查閱文獻后發現，馬兜鈴酮具有明顯的抗氧化、殺傷癌細胞活性[14-16]，因此本研究最終確定以含馬兜鈴酮在內的上述4種成分共同作為含量測定的指標成分。但目前尚未有與這4種成分相關產品的文獻報道，在后續研究中可以加強對其作用機制與毒副作用的探索，以期開發與此4種成分相關的產品服務于臨床。

本研究基于多元統計分析方法，對不同產地香附揮發油中4種主要活性成分進行了定量分析。綜合雷達圖輪廓大小及平衡情況分析結果，發現云南產香附中4種成分的輪廓最大、分布平衡度最好，且云南產香附中4種成分的總含量也最高，這提示云南產香附質量優于其他產地的樣品。聚類熱圖結果顯示，12個產地的香附樣品可聚為兩大類，產地為湖北、江西、云南、四川、廣東、山東、河南、陜西的樣品聚為第Ⅰ類，產地為廣西、山西、安徽、海南的樣品聚為第Ⅱ類，該分類結果與主成分分析結果一致;根據聚類熱圖顏色深淺、雷達圖整體輪廓大小及平衡情況判斷，本研究中第Ⅰ類產地樣品質量優于第Ⅱ類。

綜上所述，本研究所建HPLC含量測定方法可用于香附揮發油中香附烯酮、圓柚酮、α-香附酮和馬兜鈴酮的同時測定;12個產地樣品中以云南產香附藥材的質量更優。但本研究只測定了4個活性較強的揮發油類成分，指標成分較少，在后續研究中，可以增加樣品收集的產地與批次，綜合生物堿類、黃酮類、酚類等多個類別的成分作為香附的含量測定指標成分，以更加全面地評價該藥材的質量。

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（收稿日期：2020-08-10 修回日期：2020-11-04）

（編輯：林 靜）