植物富含半胱氨酸類受體激酶家族研究進展

耿艷飛，呂明芳

(1.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 杭州 311300； 2.浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州310021)

細胞-細胞和細胞與環境之間的信息交流對于植物生長發育至關重要，外界信息通過系統的級聯反應，將胞外信號傳導至胞內，細胞迅速做出應答[1-2]。類受體激酶(receptor-like kinase，RLK)是植物生長發育、激素信號傳遞、生物和非生物脅迫應答中的信號分子。植物中至少有Ser/Thr和His兩種不同的類受體激酶，1990年在玉米(Zeamays)里面鑒定到第一個植物類受體激酶[3]。從結構上看，典型的RLK包括信號肽(signal peptide)、保守的胞內激酶結構域(intracellular protein kinase domain)、跨膜結構域(transmembrane domain)和感知信號的胞外結構域(extracellular domain)，而RLK高度多樣的胞外結構域通常作為RLK亞家族分類的依據。富含半胱氨酸類受體激酶(cysteine-rich receptor-like kinases，CRKs)的胞外結構域包含DUF26，其作為植物類受體激酶的一個大家族，在感知逆境和植物生長發育過程中發揮著重要作用[1，4]。

1 富含半胱氨酸類受體激酶的結構

CRK最早是從維管植物中鑒定發現的，也被稱為DUF26 RLKs。典型的CRK由信號肽、DUF26(又稱為stress-antifungal domain，在結構域數據庫中的編號為PF01657)、跨膜結構域和胞內激酶結構域組成(圖1)[1]。不同物種里CRK同源基因很多(表1)，CRK可能來源于富含半胱氨酸類受體分泌蛋白和富含亮氨酸重復序列類受體蛋白激酶(LRR-RLKs)的融合，而且主要通過部分重復和串聯重復的方式進化[5]。例如，擬南芥14個CRK分布在4號染色體[2]，海島棉(Gossypiumbarbadense)有11個CRK位于A06和D06染色體[6]，水稻中有30個CRK位于7號染色體(圖2)。這種串聯排列方式可能有利于基因重組并加速相關性狀的進化，對于遺傳多樣性和基因功能具有重要意義[5，7-9]。

1.1 胞外結構域

含有DUF26結構域的蛋白可以分為CRRSPs、PDLP、CRK。CRRSPs含有一個信號肽，一個DUF26(sd CRRSPs)或多個DUF26；PDLP含有一個信號肽，兩個DUF26，一個跨膜區；除去N-端信號肽，CRK的胞外結構域一般含有一個或兩個保守的DUF26基序，保守的基序為C-X8-C-X2-C[1，5]。DUF26起源于分泌蛋白，是陸地植物所特有的。不同物種里的DUF26基序一般相同，比如小麥、二穗短柄草、水稻、玉米、擬南芥中均含有兩個DUF26基序，然而小麥和二穗短柄草的第一個基序為C-X9-C-X2-C，水稻、玉米、擬南芥里第一個基序為C-X8-C-X2-C(圖3)[10]。結構域中保守的半胱氨酸可能通過二硫鍵作為巰基氧化還原調控的潛在位點，還可以作為活性氧(reactive oxygen species，ROS)的傳感器，在植物防御過程中感知細胞外氧化還原的變化[2，4]。保守的Cys通過二硫鍵形成鋅指結構參與蛋白質之間的互作，維持蛋白質空間結構，C-X2-C可能是過渡金屬離子結合位點[11-13]。

圖1 CRK結構域Fig.1 Domains of CRK protein

表1 不同植物中CRK的數目

1.2 胞內結構域

激酶結構域通過磷酸化底物傳導信號，大多數CRK具有Tyr激酶活性，部分CRK已經被證實在體外具有激酶活性[14-15]。CRK胞內激酶結構域(PF00069)包括ATP結合結構域(ATP binding site)、底物結合位點(substrate binding site)或化學結合位點(chemical binding site)和活化環(activation loop)[2]。活化環對于激酶活性至關重要，環中絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化會導致活化環構象發生變化，使得ATP和底物能夠進入活性中心[1，16]。擬南芥CRK5激酶催化結構域中Lys-368是和CRKIP互作所必需的[17]，CRK6和CRK7激酶活性對金屬離子具有不同的偏好性，CRK6磷酸化MBP依賴于Mn2+，而CRK7更傾向于Mg2+[18]。

A，OsCRKs基因的系統發生樹；B，OsCRKs基因在水稻染色體上的分布。A， The phylogenetic tree of OsCRKs；B， OsCRKs distribution on chromosomes of rice.圖2 水稻CRKs基因的系統發生樹和在染色體上的分布Fig.2 Phylogenetic tree and distribution on chromosomes of rice CRKs

圖3 不同物種中DUF26 結構域Fig.3 DUF26 domain in different species

1.3 跨膜結構域

跨膜結構域(transmembrane domain，TM)由22～28個氨基酸構成，連接細胞內外不同的結構域，將胞外信號傳導到胞內，同時還起到定位蛋白的作用。大多數CRK蛋白都含有TM，而缺少TM的CRK被稱為胞質類受體激酶(RLCKs)。跨膜結構域決定了蛋白的位置，大多數CRK蛋白為膜結合蛋白，預測分析表明，二穗短柄草、大麥、水稻、高粱、小麥等作物中90%以上的CRK蛋白定位在細胞質膜上，少數定位在細胞外或線粒體[8]。目前沒有關于CRK定位在葉綠體上的報道，所以還不清楚CRK如何參與葉綠體之間的信息交流，推測它們參與質外體和葉綠體之間的信息交流可能與PAMAP誘導的免疫反應途徑相似[18-19]。

2 CRKs在植物生長發育中的作用

CRK在植物生長發育過程中具有重要作用，擬南芥中已經陸續報道了部分CRK的功能，其他植物中關于CRK的功能研究還相對較少。然而，研究發現大多數擬南芥CRK突變體和過表達植株與野生型相比表型沒有差異，而CRK家族又十分龐大，推測是CRK功能冗余造成的[17]。目前已經報道的CRK主要參與調控根、葉等營養器官的發育以及植物生長周期。

2.1 CRK參與調控根、葉器官的形成

擬南芥CRK28通過負調控葉片表皮毛，正調控根毛影響植物形態建成。主根的生長依賴于根尖分生組織的細胞分裂，CRK28通過抑制分生組織的分裂影響初生根的形成；與野生型相比，crk28突變體主根增長15%～20%，而過表達CRK28轉基因植株主根縮短40%[20]。Bourdais等[11]也發現crk28、crk29、crk42突變體相比于野生型根長有所增加。擬南芥過表達CRK5導致幼苗時期主根變短，但是在成熟期和野生型生長狀態一致[21]。CRK功能之間的差異意味著其在調控植物根長方面發揮著重要作用。根毛是由表皮細胞形成的，具有吸收水分和營養物質的功能。CRK28通過抑制側根原基(LRP)的形成影響側根發育，與野生型相比，crk28突變體根毛縮短，數量減少，而過表達CRK28植株根毛數量和長度都明顯增加；表皮毛是莖和葉片中的表皮細胞分化而成的，可以調節植物蒸騰作用和保護植物免受昆蟲和病原菌侵害，CRK28通過負調控葉片表皮細胞的分化，影響葉片表皮毛的形成[20]。

2.2 影響植物發育階段的轉換

擬南芥CRK28、CRK45參與調控植物生長發育。crk28突變體促進擬南芥早期生長發育，但是突變體在成熟期略矮于野生型，花環直徑略小；過表達CRK28植株早期生長發育延遲，成熟期和野生型株高一致，花環直徑增大[20]。Yadeta等[22]發現，過表達CRK28植株早期生長矮小，花序分枝數增加，果莢變小。二者均發現過表達CRK28導致花序分枝數增加，早期生長發育延遲[20]，其研究是一致的。CRK45影響擬南芥抽薹時間，過表達CRK45延遲抽薹，而突變體提前抽薹，隨后的生長發育過程中，同時發現過表達CRK45長勢優于野生型，株型增大、生長周期延長、延緩衰老[23]。Bourdais等[11]通過研究大量擬南芥CRK突變體庫發現，crk2突變體植株矮小，在crk2突變體中過表達CRK2能夠恢復其表型。此外，4個crk突變體(crk7、crk16、crk19、crk38)提前開花，34個crk突變體開花后早衰。

擬南芥CRK5通過兩種途徑影響植株衰老。CRK5通過負調控乙烯信號通路，參與衰老過程。crk5突變體真葉形成不久后，水楊酸和乙烯逐漸積累，子葉細胞出現凋亡，葉片早衰；同時發現CRK5啟動子區域含有大量WRKY轉錄因子結合位點(W-Box)，CRK5可能通過WRKY53和WRKY70轉錄因子調控擬南芥衰老；進一步在crk5突變體過表達CRK5能夠恢復到野生型[24]。Chen等[12]發現，在野生型中過表達CRK5(較低水平)促進葉片生長，生物量增加，二者研究是一致的。Bourdais等[11]發現，在crk5突變體中過表達CRK5導致花環略微增大，過量表達CRK5則引起細胞程序性死亡，二者研究中的差異可能與CRK5的表達水平或植株的培養條件有關。

3 CRKs在生物脅迫中的功能

當植物受到病原菌侵染時，外界信號傳導到胞內，啟動相應的防御反應。病原相關分子模式所觸發的免疫反應(PAMP-triggered immunity，PTI)是植物初級免疫反應的第一道防線，通過產生ROS或者胼胝質的積累進行免疫防御；第二道防線是植物次級免疫，在該途徑中通過水楊酸(salicylic acid，SA)的積累，引起細胞程序性死亡[25]。CRK作為生物脅迫和非生物脅迫信號途徑中一個重要分子，參與調控植物免疫反應。大多數CRK受病原菌誘導表達，例如擬南芥CRK5、CRK13、CRK20參與對病原菌PstDC3000的抗性。大豆中76個CRK啟動子區域含有生物脅迫響應元件，意味著CRK在脅迫應答中起著重要作用[8]。

3.1 CRK參與ROS產生和胼胝質沉積

植物受體類激酶和ROS促進了細胞和外界環境的信息交流，質外體ROS在病原體防御應答中起著重要作用，CRK參與ROS的產生[26]。Yeh等[27]發現，在flg22和PstDC3000誘導下，擬南芥過表達CRK4、CRK6、CRK36植株中ROS積累。flg22誘導下，擬南芥11個crk突變體ROS含量顯著上調，4個crk突變體中ROS含量下調；crk5和crk28突變體中ROS表達量和野生型基本一致，而突變體對PstDC3000更敏感；與野生型相比，crk23突變體中ROS被顯著誘導表達，但是其對PstDC3000的敏感性和野生型一致，表明CRK參與ROS的產生，但是其相關機制還不清楚[11]。水稻類病變突變體lil1中，LOC_Os07g30510編碼CRK，當該激酶催化結構域中第429位Val突變為Ile后，該基因表達量上調，ROS異常積累，抗病相關基因上調表達，誘導細胞程序性死亡，增強了對稻瘟病的抗性[28]。CRK對病原菌的嚴格調控暗示了CRK與氧化還原或ROS相關過程存在聯系[26]。

胼胝質沉積是典型的后期PTI應答反應[28]。CRK36正向調節PTI和效應蛋白誘導免疫(ETI)應答，與野生型相比，flg22誘導下，過表達CRK36植株中，ROS產生，胼胝質沉積 ，FLS2是flg22的模式識別受體，通過BiFC發現，CRK4、CRK6、CRK36與模式識別受體FLS2互作形成模式識別受體復合物。過表達CRK4和CRK6并沒有影響PTI介導的胼胝質沉積，而CRK36在PTI應答中正調控胼胝質沉積[29]。

3.2 CRK 參與氣孔關閉

氣孔是調控植物應對干旱脅迫，病原菌感染和其他刺激反應的關鍵結構。氣孔關閉依賴于脫落酸和其他植物激素的信號之間的相互作用，CRK參與氣孔免疫應答。研究發現，flg22能誘導擬南芥氣孔關閉，在過表達CRK36植株中，PTI應答基因FRK1顯著上調，氣孔被強烈誘導關閉，而crk36突變體中氣孔關閉受阻；BIK1通過磷酸化NADPH氧化酶RbohD調節氣孔免疫，PTI應答中CRK36磷酸化BIK1，在bik1和rbohD/F突變體中過表達CRK36發現，氣孔免疫受阻，CRK36、BIK1和NADPH氧化酶共同促進ROS的產生，增強氣孔免疫反應，誘導PTI應答基因的表達[29]。PstDC3000誘導下，CRK6正向調節氣孔的關閉，在PstDC3000誘導下，過表達CRK6誘導氣孔關閉。而過表達CRK4或CRK36阻止PstDC3000介導的氣孔重新開放存在缺陷[27]。CRK同時也參與ABA誘導的氣孔的關閉，與野生型相比，擬南芥crk22、crk24、crk37、crk46突變體增強ABA誘導的氣孔關閉，crk突變體中氣孔密度減少，孔徑增大[11]。因此，CRK在調控氣孔免疫應答中發揮著重要作用。

3.3 CRK參與植物次級免疫反應

植物在長期面對生物脅迫過程中還進化出了R基因等，用以監控、識別效應子，引起細胞壞死等過敏反應，以阻止病原菌的入侵。而CRK基因參與該免疫反應過程，比如：擬南芥CRK4、CRK13、CRK20和CRK36被SA和病原菌顯著誘導表達。接種PstDC3000后，CRK13快速作出應答，相關PR基因PR1和PR5隨后也被誘導表達，異源表達CRK13誘導抗性相關ICS1基因通過參與SA的合成調控SA介導的防御途徑，引起細胞程序性死亡；CRK13可能作為PR基因或ICS1信號途徑中的上游調控基因發揮作用[30]。擬南芥CRK45受NPR1和WRKY70的調控，CRK45通過誘導PR相關基因和SA的積累防御病原菌[31]，在PstDC3000誘導下，過表達CRK36植株中ROS積累量較多，PR基因上調表達；突變體中ROS含量相對較少，PR基因下調表達，與野生型相比，過表達CRK36強烈誘導細胞程序性死亡，而突變體中相對較弱[29]。擬南芥CRK20受PstDC3000誘導表達，crk20突變體中病原體數量減少，但是水楊酸含量和水楊酸相關的防御基因的表達量與野生型相比卻沒有差異，CRK20啟動子可能有利于PstDC3000的生長[32]。海島棉GbCRK18被黃萎病誘導表達，在大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)侵染下，GbCRK18誘導的沉默植株葉片枯萎，相關真菌生物量增加，PR基因PR3、PR4、PR12顯著下調，對病原菌的易感性增加[5]。

CRK13的表達水平對于擬南芥形態發育起著重要作用。組成型CaMV 35 S啟動子過表達CRK13植株在生長過程中逐漸死亡，均不能正常生長到成熟期；通過類固醇誘導的Gal4啟動子誘導表達CRK13，擬南芥葉片組織塌陷，細胞程序性死亡。CRK13賦予的細胞程序性死亡受SA依賴型和非依賴型調控，在有無SA積累時，過表達CRK13均能夠引起細胞程序性死亡[30]。而Yeh等[27]獲得了穩定的過表達CRK13(表達量相對較低)植株，可能是CRK13表達水平或者培養條件造成了差異。過表達植株中CRK5的表達方式或表達水平激活不同的防御反應。較低水平組成型表達CRK5通過正向調節生物量的產生，促進葉片生長，增強抗病反應；通過類固醇誘導的Gal4啟動子誘導表達CRK5導致超敏反應的發生，葉片細胞死亡[12]。擬南芥中通過類固醇誘導CRK4、CRK19、CRK20均可以誘導細胞死亡，而Yeh等[27]獲得的CRK4過表達株系沒有出現細胞程序性死亡，可能是CRK4的表達水平造成的差異。

4 CRKs在非生物脅迫中的功能

植物在生長發育過程中除了受到生物脅迫外，還容易受到非生物脅迫的影響。植物通過一定的方式感知外界脅迫，CRKs也參與激素、鹽、高溫、干旱、氧化還原應激等非生物脅迫應答，研究發現，大多數CRK同時參與生物與非生物逆境脅迫。

4.1 CRK參與激素應答

脫落酸(abscisic acid，ABA)介導植物參與許多非生物脅迫應答，ABA和非生物脅迫作為信號分子誘導或者增強脅迫應答基因的表達，ABA通常抑制根的生長和種子萌發[33-34]。CRK在ABA信號通路中發揮著不同功能。在擬南芥萌發和幼苗生長階段，CRK28參與種子休眠響應的ABA應答；ABA脅迫處理條件下，與野生型相比，過表達CRK28植株對ABA更敏感，野生型在72 h時發芽率達到100%，而過表達CRK28 發芽率不到20%[20]。Lu等[21]也發現，在ABA處理后，擬南芥過表達CRK5植株對根長的抑制作用比野生型更顯著，二者研究是一致的。CRK45是擬南芥幼苗早期ABA抑制發育信號通路的重要調節因子，CRK45通過與CRK36互作響應ABA應答，CRK45過表達植株中ABA應答基因ABI1、ABI2、ABI5、KIN1、MYB2顯著上調，導致了CRK45過表達植株對ABA更敏感[23]，而敲除突變體crk36對ABA更敏感，進一步研究發現，CRK36通過磷酸化ARCK1調控ABA信號轉導途徑，并且CRK36對ABA之外的激素無應答[29]。同時在擬南芥中異源表達TaCRK41能夠減輕ABA對發芽的抑制效應[35]。GbCRK18可以被茉莉酸(jasmonic acid，JA)誘導表達，但是不受SA和ABA的影響，GbCRK18可能參與JA信號途徑的防御反應[6]。

4.2 CRK參與鹽脅迫

擬南芥CRK45調節鹽脅迫條件下種子的萌發和幼苗發育。100 mmol·L-1NaCl處理條件下過表達CRK45抑制種子萌發，而crk45突變體促進種子萌發[23]；Bourdais等[11]發現，在120 mmol·L-1NaCl處理條件下，21個擬南芥crk突變體發芽延遲，表明CRK在鹽脅迫條件下發揮著不同作用[33]。小麥102個CRK基因響應鹽脅迫應答，大多數CRK基因在鹽脅迫處理幾個小時后上調表達，而TaCRK82-A和TaCRK61-A下調表達[7]。擬南芥CRK20可以被甘露醇顯著誘導表達，然而，在高鹽條件下CRK20被抑制表達[32]。擬南芥組成型表達TaCRK41降低了對滲透壓的敏感性，在鹽脅迫條件下，擬南芥中異源表達TaCRK41可以提高萌發速率[35]。

4.3 CRK參與干旱脅迫

RNA-seq數據分析發現，在干旱和熱脅迫條件下，小麥128個TaCRK差異表達，大多數TaCRK基因受干旱脅迫誘導表達，少數基因在高溫脅迫條件中下調表達。在干旱和高溫脅迫下TaCRK16-A和TaCRK68-A上調表達；異源表達TaCRK68-A可以增強大腸埃希菌和酵母細胞對低溫、干旱、鹽、高溫脅迫的耐受性[7]。CRK45增強擬南芥抗干旱能力，干旱脅迫條件下，過表達CRK45植株存活率更高[23]。CRK4和CRK5通過增加對ABA的敏感性提高植物抗旱能力，CRK5過表達植株中ABA積累，通過抑制氣孔開放最大程度地減少葉片水分蒸發，達到抗旱作用[24]。

4.4 CRK參與氧化還原應激反應

一些CRK參與感知或適應ROS或氧化還原平衡的變化，并可能參與信號轉導過程。

線粒體和過氧化物酶體是植物細胞內產生ROS的主要細胞器，紫外線或O3脅迫也能夠誘導ROS的產生。紫外線誘導擬南芥CRK5的表達，在紫外線脅迫條件下，與野生型相比，crk5 突變體中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等ROS清除系統激活延遲，細胞內產生嚴重的氧化損傷[24]。Bourdais等[11]也發現，紫外線脅迫條件下，擬南芥crk2、crk5、crk40和crk42突變體細胞膜損害程度比野生型嚴重，二者是一致的。擬南芥CRK對O3的反應比較微妙。O3脅迫條件下，大多數擬南芥突變體如crk3、crk31等的細胞膜出現損傷，crk突變體增強O3誘導的細胞死亡[12]。Ederli等[32]發現，O3脅迫條件下，野生型與突變體crk20中CRK4和CRK19均被誘導上調表達，并且其表達量在野生型和突變體中沒有差異；crk20和野生型細胞質膜受損情況一致，同時，Id?nheimo等[18]也發現，擬南芥突變體crk6和crk7與野生型對O3的敏感性一致，推測是基因功能冗余造成的。

5 結論與展望

富含半胱氨酸類受體激酶是受體類激酶中的大家族，在植物逆境脅迫和生長發育過程中發揮重要作用。如表2所示，我們對目前植物中已經報道的CRK做了系統總結，大多數CRK不僅可以對病原菌flg22和PstDC3000等生物脅迫作出應答，而且能夠響應植物激素、鹽、高溫、干旱等非生物脅迫，僅少量CRK對病原菌或非生物脅迫沒有應答。CRK表達量的變化雖然對植株的株型沒有明顯的影響，但是可以通過調控植株根，葉及發育階段轉化等影響植株的生長發育。

目前CRK蛋白功能的研究主要是在擬南芥中進行的，但是對于其功能的研究仍不夠深入，還面臨著以下幾個問題：(1)CRK作為正調控或負調控因子對細胞-細胞之間或環境信號做出應答，但CRK信號通路中配體卻知之甚少。雖然CRK的胞外結構域相同且大多CRK可能具有相似的功能，但我們對 CRK和配體特異性識別的機制并不了解。(2)ROS對于病原菌入侵和其他環境信號的感知，在一定程度上可能與CRK信號密切相關，但CRK作為ROS產生的下游特異信號的機理尚不清楚[26]。另外，CRK與其他受體和RLKs相互作用，以及其參與植物免疫應答中的具體機制還不清楚。因此，研究CRK的功能，揭示植物對逆境脅迫應答機理對于提高農作物抗逆境能力具有重要意義。