甲狀腺癌相關基因和RNA分子標志物的研究現況

劉穎，劉閣玲

(華北理工大學附屬唐山市工人醫院內分泌一科，河北 唐山)

0 引言

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤，約占全球所有癌癥的2.1%，其中約77%的病例發生在女性[1]。甲狀腺癌是美國女性中第五大最常見的癌癥，據估計2015年男女新發病例超過62 000例[2]。全世界甲狀腺癌的發病率持續上升，但死亡率增長不明顯，大多數甲狀腺癌患者具有良好的自然病史[3]。根據組織病理學特征，甲狀腺癌可分為四種主要類型：甲狀腺乳頭狀癌(PTC)、濾泡性甲狀腺癌(FTC)、髓樣甲狀腺癌(MTC)和間變性甲狀腺癌(ATC)。PTC占甲狀腺癌的70-80%，是TCs的主要組織學類型。對于甲狀腺癌是否需要早期診斷和治療是目前臨床討論的熱點，并且有很多不一致的觀點。

由美國臨床內分泌醫師協會(AACE)，美國內分泌學院(ACE)和美國醫學內分泌協會(AME)聯合制定了甲狀腺結節診斷和管理的臨床實踐指南，目前在2016年更新的指南中指出[4]，在高達50%-60%的健康體檢者中可發現甲狀腺結節，大多數甲狀腺結節并不會引起明顯的臨床癥狀，對于這部分結節的處理最主要的問題就是區分結節的良惡性，超聲檢查(US)和細針穿刺活檢(FNA)是診斷的甲狀腺結節良惡性的基石。指南中推薦所有有明顯甲狀腺結節或臨床危險因素的患者均應行超聲檢查。影像學和細針穿刺活檢技術的日益普及和發展，為發現和診斷隱匿的、比較小的、原本無法通過癥狀或觸診發現的甲狀腺癌提供了更多的機會。甲狀腺癌的第一步診斷依賴于FNAB，其中約有25%的結節良惡性不能確定，對于不確定良惡性的結節可進行重復穿刺或診斷性手術[5]。在2015年的ATA指南中提出[1]，建議對甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌患者的診斷、評估和治療采取更加謹慎的方法。分子檢測目前被討論作為超聲引導下細針穿刺活檢技術的輔助手段，當細胞學對甲狀腺結節的性質不確定的情況下，可以更好地分流惡性腫瘤的風險，從而潛在地減少診斷性手術的發生率。

因此發現新的診斷方法和新的生物學標記物是甲狀腺結節診斷中的日益增長的需求，并可以消除不必要的重復FNABs和外科手術。近年來，在了解甲狀腺癌的發生和關于其分子標志物的研究上取得了很大的進步。分子生物標志物包括編碼和非編碼 RNA，在多種疾病中發揮重要作用，并已被用作輔助診斷工具。在甲狀腺癌中包括基因突變、蛋白和mRNA標志物如 BRAF、RAS 和半乳凝素3等已被用于改善患者甲狀腺結節診斷準確性[6]。本文將概述近幾年的在甲狀腺癌診療方面有進展和研究熱門的基因生物標志物。

1 甲狀腺癌相關經典基因分子標記物

已在人類乳頭狀甲狀腺癌(PTC)中鑒定出四種癌基因的遺傳學改變，即RAS點突變，RET重排(RET/PTC)，NTRK1重排(TRK)和BRAF點突變。這些癌基因沿著RET/PTC(TRK)-RAS-BRAF-MEK-MAPK激酶途徑起作用，介導許多細胞的生長、凋亡，包括甲狀腺細胞的生長，增殖和存活[6]。

1.1 BRAF基因突變

BRAF是分化型甲狀腺癌(DTC)中最常見的突變基因類型，而BRAF V600E基因突變在PTC中被認為是最常見的基因事件，且BRAF V600E突變在PTC具有特異性[7]。約有一半的PTC患者中存在該基因的突變[8]。BRAF V600E基因突變的檢測可以減少由于細針穿刺細胞學檢查結果良性而對乳頭狀甲狀腺癌的漏診，Chen X[9]等人建議對于≥2個可疑超聲特征的高危甲狀腺結節，應常規進行細針穿刺并進行BRAF V600E突變檢測。既往大量研究已證實，BRAF V600E突變與腫瘤更高的侵襲性和更高的術后復發風險密切相關，與PTC預后不良之間呈正相關。BRAF V600E突變分析不僅可以用于PTC的診斷，而且可以預測其預后[10]。Wang F[11]等人回顧了六個國家11個研究中心的2638例患者中BRAF狀況與男性性別與PTC臨床病理結果(尤其是死亡率)之間的關系研究認為，男性是導致BRAF V600E患者PTC特異性死亡的有力獨立危險因素。Mathur A[12]等人所在的機構中，BRAF V600E突變率在15年內顯著增加，研究者認為隨著時間的推移乳頭狀甲狀腺癌的BRAF突變率更高，BRAF突變率增高可能與甲狀腺癌的發病率增加相關。

1.2 RAS基因突變

RAS基因突變是甲狀腺癌中僅次于BRAF的常見突變類型[13]。既往很多臨床醫生都已經認可RAS突變提示惡性腫瘤的發生。盡管一些資料顯示RAS基因突變可能會增加惡性腫瘤風險，但大多數RAS陽性的甲狀腺癌都有低風險表型。細胞學良性而RAS突變陽性的甲狀腺結節可以多年處于不活躍狀態[14]。最近的研究發現[15]：RAS陽性的甲狀腺結節通常具有不確定的細胞學特征，而且RAS陽性突變的發現可以識別出大量良性病變以及甲狀腺癌。最新報道的一項前瞻性研究[16]，對術前的細針穿刺活檢時發現攜帶RAS突變的結節進行前瞻性地追蹤，其中80例RAS陽性結節中有56例進行了手術，其中33例(58.9%)被確認為良性，7例(12.5%)是具有乳頭狀核特征(NIFTP)的非侵入性甲狀腺濾泡性腫瘤，16例(28.6%)是甲狀腺癌。所以RAS突變單獨發生時，不能用于識別Bethesda III / IV細胞學類型的惡性腫瘤，但可以預測腫瘤的良性行為。

1.3 TERT啟動子突變

在許多人類惡性腫瘤中發現了刺激TERT轉錄和端粒酶激活的TERT啟動子突變，其中最常見的TERT啟動子突變是C228T和C250T。2013年在甲狀腺癌中發現端粒酶逆轉錄酶(TERT)啟動子突變[17]。此后在此方面的研究取得了許多進展。Melo M[18]等人對204位患者的437個組織樣本進行了突變分析，主要是甲狀腺乳頭狀癌(PTCs；n=180)，所有標本中包括196位有淋巴結轉移和56位遠處轉移。發現端粒酶逆轉錄酶啟動子(TERTp)在原發性PTC，淋巴結轉移和遠處轉移中突變頻率分別為：12.9%，10.5%和52.4%；遠處轉移顯示TERTp突變豐富，表明TERTp突變可能在遠處轉移中起作用。在一項納入了13項研究收集了4347例PTC患者的mate分析研究[19]，端粒酶逆轉錄酶(TERT)啟動子突變與BRAFV600E突變具有協同關聯，并且驗證基因二重性在甲狀腺乳頭狀癌中的作用，兩個基因突變的共存與高風險臨床病理特征的關系遠比單獨一個基因的突變作用更強。有研究表明[20]，TERT啟動子突變的存在與分化型甲狀腺癌患者死亡率的增加獨立相關。也有研究[21]發現BRAFV600E和TERT啟動子突變可以共存于甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中。BRAFV600E和TERT啟動子突變基因二重體被認為與PTC的侵襲性有關，而且遺傳二重性與更高的死亡率相關聯。TERT啟動子突變的發現代表了甲狀腺癌中一個重要的新致癌基因，并且該突變有望成為甲狀腺癌的新的診斷和預后遺傳標記，與BRAFV600E突變或其他遺傳標記(例如RAS突變)結合使用可證明在臨床上對甲狀腺癌的治療有作用[22]。

2 甲狀腺癌相關RNA分子標志物

有研究表明mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA可與競爭性內源性RNA(ceRNA)相互作用，形成ceRNA調控網絡，在腫瘤發生、發展過程起一定的作用。

2.1 miRNA與甲狀腺癌

近年來，針對分子標記物的研究日益成為研究熱點，而其中以針對miRNA的研究較為集中。越來越多的研究證實miRNA在各類甲狀腺癌的發生發展、輔助診斷、治療以及預后等各方面都可作為重要的分子標志物。miRNA被認為是甲狀腺癌最具潛能的新型生物學標志物之一[23]。

MicroRNA (miRNA)是一種高度保守的單鏈小分子非編碼RNA，約21～23bp，具有轉錄后調控基因表達的功能[24]。microRNA通過與mRNA互補結合抑制蛋白翻譯或導致mRNA降解，干擾mRNA指導蛋白合成過程，從而負向調節蛋白編碼基因的表達[25]。功能研究已經證實，許多癌癥的發生與miRNA失調相關，miRNA充當原癌基因或抑癌基因的作用[26]。miRNA的異常表達調節腫瘤細胞生長、增殖和凋亡等。與正常甲狀腺組織相比，miRNA221，miRNA222[27]和miRNA146b[28]在PTC組織中高表達在之前已經被證實，而Pamedytyte[29]等人研究證明 miR-146b，miR-222，miR-21和miR-221的較高水平表達與PTC患者初始手術時的腫瘤大小和淋巴結轉移有關。據相關研究證明miR-146b失調與PTC的侵襲性以及預后相關。miR-146b在乳頭狀甲狀腺癌中高表達，具有高風險特征，包括甲狀腺外侵襲和BRAF(V600E)突變[28,30]。Perdas[31]等人研究發現miRNAlet-7可以降低RAS水平，在PTC中起抑癌基因的作用。而且發現循環中的miRNAlet-7家族基因表達譜可用作PTC的新型非侵入性診斷、預后、治療和監視標記。最新研究證明與相關的非癌組織相比，PTC腫瘤組織中的miR-188-5p下調，miR-188-5p過表達抑制PTC 癌細胞增殖，主要通過沉默miR-188-5p相關的成纖維細胞生長因子5(FGF5)[32]。根據最近報道的，在PTC組織中表達明顯降低的miRNA還有miR-451a[33]。You[34]等人檢測了PTC組織和細胞中miR-203的表達情況，并通過細胞實驗驗證，上調TPC-1細胞和K1細胞的miR-203可抑制上皮-間質轉化(EMT)，侵襲，增殖和遷移。在最近的薈萃分析中[35]，Xu等人總結了包括9篇文章中的35項研究，在納入的文獻中，表達上調的循環miRNA主要有let-7e、miR-151-5p、miR-222、miR-190、miR-146b、miR-155、miR-25-3p、miR-451a、miR-124-3p、miR-9-3p、miR-221、miR-21；表達下調的主要有miR-29b、miR-95、miR-579、miR-196b-5p、miR-663。Xu等人評估在663份血清或血漿樣本中檢測循環miRNA用于甲狀腺癌的診斷特征。得出結論認為循環中的miRNA對甲狀腺癌的診斷和鑒別甲狀腺癌與甲狀腺良性結節(BTN)有較好的價值，循環miR-222和miR-146b可能有潛力成為鑒別TC和BTN的診斷工具。

2.2 lncRNA在甲狀腺癌中的研究

lncRNAs是指長度超過200個核苷酸，大小在200 bp到100 kb之間的RNA分子[36]。根據定義，lncRNAs不編碼蛋白質，它們通常比mRNA短，因為它們的外顯子較少。既往研究已證明，lncRNA表達異常在癌癥的發生和進展中起作用。lncRNAs 在細胞周期調節中包括細胞分化、增殖、遷移、侵襲和凋亡中均可發揮作用。Wei Lu[37]等人從TCGA數據庫中下載了甲狀腺癌和正常甲狀腺組織的RNA測序數據，從GEO數據庫下載了公開的甲狀腺癌RNA測序和lncRNA芯片數據(GSE83520、GSE66783、GSE103254)。并進一步對數據庫中的lncRNAs進行差異分析，結果顯示，在甲狀腺癌組織中有數千個lncRNA差異表達，這可能是診斷甲狀腺癌的潛在有用的生物標志物。Wei Lu等人為驗證分析結果，選擇了lncRNA LINC00704(也稱為MANCR)進行實驗驗證，將LINC00704轉染到甲狀腺癌細胞BHT101和BCPAP中，研究表明下調LINC00704會損害甲狀腺細胞的增殖，抑制細胞周期的進展。在甲狀腺癌中，已有幾種lncrna (MALAT1、H19、BANCR、HOTAIR)被鑒定為促進腫瘤發展的因子，可以作為早期診斷甚至治療的新生物標志物[38]。據研究，與正常甲狀腺組織相比，甲狀腺癌組織和甲狀腺癌細胞中MALAT-1的水平更高，IQGAP1的表達更高，lncRNA MALAT1在甲狀腺癌中表達上調，可能通過調節IQGAP1的表達促進甲狀腺癌細胞的增殖和侵襲[38]。LncRNA-MALAT-1通過調節腫瘤相關的巨噬細胞FGF2蛋白分泌促進甲狀腺癌的血管生成[39]。Lin Liu[40]等人報道lncRNA H19在甲狀腺癌組織和細胞中過表達，過表達的H19促進癌細胞生長，遷移，H19與miR-17-5p競爭性結合，而充當競爭性內源RNA(ceRNA)，H19拮抗miR-17-5p上調其靶標YES1的功能，并抑制miR-17-5p誘導的細胞周期進程。據研究[41]，HOXD-AS1在甲狀腺乳頭狀癌組織和細胞系中過表達。HOXD-AS1的高表達與老年人，臨床晚期，腫瘤大，淋巴結轉移和遠處轉移有關，得出結論HOXD-AS1是預測甲狀腺乳頭狀癌臨床進展的生物標志物。Zhou[42]等人證實，與結節性甲狀腺腫相比，PTC患者的腫瘤組織和血漿樣品中的lncRNA CASC2表達顯著下調。lncRNA CASC2在有淋巴結轉移(LNM)的PTC患者的血漿中表達降低，并被認為是LNM患者的獨立風險。此外，功能分析表明lncRNA CASC2的過表達抑制了PTC的細胞增殖，遷移和侵襲。lncRNA RGMB-AS1在PTC組織和細胞中表達上調，高度表達的lncRNA RGMB-AS1促進PTC的增殖，侵襲和遷移[43]。甲狀腺癌腫瘤組織中的DARS-AS1水平明顯升高，與甲狀腺癌的病理分期，遠處轉移及預后不良有關，此外，甲狀腺癌組織中microRNA-129和DARS-AS1水平呈負相關。DARS-AS1可以通過調節microRNA-129來促進甲狀腺癌細胞的增殖和遷移能力[44]。通過已建立的miRNA-RNA數據和超幾何學測試，證實了LncRNA-mRNA的相互作用。通過將差異表達的基因與RNA-RNA網絡整合在一起，構建了PTC相關的lncRNA-miRNA-mRN網絡。研究發現lncRNA RP11-159F24.1在PTC中上調，其目標miR-485下調，兩者在PTC患者中表達模式呈負相關，表明RP11-159F24.1/miR-485/mRNA軸可能在PTC的開發中起重要作用[45]。研究表明，miR592的過表達抑制甲狀腺癌的細胞增殖，遷移和侵襲，神經腫瘤腹側抗原1(NOVA1)被發現為甲狀腺癌細胞中miR592的新型靶基因，lncRNA NEAT1被認為在甲狀腺癌細胞中充當miR592的海綿，從而調節NOVA1的表達。

2.3 circRNA與甲狀腺癌

環狀RNA(circRNA)是一類新型的RNA，具有更高的穩定性和組織特異性，可能作為新型臨床標志物具有價值。

已有研究發現一些失調的circRNA與BRAFV600E突變，腫瘤包膜浸潤，腫瘤PT分期和淋巴結轉移有關，表明circRNA可能參與腫瘤的發生和癌癥的發展，它們可能是診斷和評估的PTC的進展的生物標志物[46]。Shi Erlan[47]等人通過PCR檢測113例PTC患者、80例甲狀腺良性結節和111例健康對照者血清環狀circRNA表達譜，結果顯示，與健康對照組和甲狀腺良性結節組相比，PTC患者中circRAPGEF5和hsa_circ_0058124兩種circRNA表達顯著上調，并且在識別PTC患者方面，聯合circRNA優于單獨的circRNA。通過實驗研究發現[48]，甲狀腺癌組織和細胞系中的hsa_circ_0102272顯著升高；與hsa_circ_0102272低表達的患者相比，hsa_circ_0102272高表達的患者顯示出顯著較短的總生存期和無進展生存期。最新研究發現，CircTP53是在甲狀腺癌組織中高表達的circRNA，高表達的circTP53通過靶向miR-1233-3p / MDM2軸降低了p53蛋白水平，并促進癌細胞的增殖[49]。Xia F[50]等人研究表明，Hsa_circ_0011385在甲狀腺癌中表達上調，Hsa_circ_0011385通過靶向miR-361-3p促進了甲狀腺癌細胞的增殖，侵襲和遷移，并抑制了甲狀腺癌細胞的周期阻滯和凋亡。Wu G[51]等人通過RT-PCR檢測circFNDC3B在PTC組織和PTC細胞系中的表達，用抗circFNDC3B的小干擾RNA(siRNA)穩定轉染PTC細胞，并在細胞實驗中檢測細胞增殖，遷移和侵襲，同時在裸鼠中檢測腫瘤發生。在這項研究中，研究者觀察到circFNDC3B在PTC組織和細胞系中被上調，并且還證明了PTC患者的血清外泌體中circFNDC3B上調。近年來對于circRNA的研究取得進展的主要有：CircRNA_102171[52]、CircNEK6[53]、circBACH2[54]、circNUP214[55]、Circ_0067934[56]、circRAPGEF5[57]等因子在甲狀腺癌中表達上調；Hsa_circ_0058124[58]等因子促進PTC細胞增殖、侵襲和轉移。

3 小結

近年來甲狀腺結節及甲狀腺癌的發病率較以往有了明顯的增長，其中大部分結節為良性結節，小部分為惡性結節，因此，鑒別其良惡性對臨床醫生和患者來說有著重要意義。目前，通過臨床觸診、超聲、核素顯像及FNAB等方法綜合評價，在一定程度上可以提高診斷的準確性，但仍有一部分不能明確診斷。近年來，隨著分子遺傳學的研究的不斷深入和發展，為甲狀腺癌的精確診斷及預后判斷提供了大量的理論依據。對甲狀腺癌的診斷和治療也從經驗醫學層面逐步發展到詢證醫學到當今的精準醫學層面，一些分子標志物的應用顯著提高了對甲狀腺結節性質的診斷準確性，避免了診斷性甲狀腺手術的發生，并對預后的判斷也有一定的意義。分子標志物的應用在甲狀腺癌的診斷和預后評估上將發揮越來越重要的意義。

4 展望

目前對于甲狀腺癌相關分子標志物的研究雖然比較廣泛，但不同研究者對于研究的結果和結論仍然存在一定爭議，且目前對于分子標志物在甲狀腺癌中的作用機制尚未完全明確和被廣泛認可，臨床上對于甲狀腺癌分子標志物的應用并不廣泛，缺乏理論和技術支持，所以今后在甲狀腺癌分子標志物方面的研究仍有很大的研究空間及必要性。腫瘤的發生是一個多因素的結果，可能存在多種基因或分子的異常表達，單一的分子標志物對甲狀腺癌的診斷存在一定的局限性。今后的在甲狀腺癌分子標志物的研究方面可發展多種基因或分子聯合檢測的方法，或可大幅度提高甲狀腺癌的診斷率，同時應該著重發展在臨床工作中高靈敏性、高特異性、低成本-高收益并操作簡單的生物學標志物。希望隨著研究的不但進展，生物學標志物在甲狀腺癌的診斷、預后和治療上發揮越來越顯著的作用。