CAR-NK細胞：腫瘤免疫治療的新方法

石亞群，俞妍慧

(1.長治醫學院 研究生院，山西 長治；2.長治醫學院附屬和平醫院 血液科，山西 長治)

0 引言

CARs由細胞外抗原結合域(通常是來自單克隆抗體的單鏈可變片段(ScFv))和細胞內信號域(通常是TCR-CD3ζ鏈)組成[1]。雖然針對T細胞的CARs技術已廣泛用于臨床，但對CAR-NK細胞的研究很大程度上仍處于臨床前階段。然而，CAR-T細胞在淋巴系統惡性腫瘤中的不良反應及其針對實體腫瘤的局限性[2]推動了CAR-NK細胞用于臨床的進一步研究。

1 NK細胞分類及其優勢

自然殺傷細胞是機體重要的免疫細胞，NK細胞通過基因編碼的抑制性和激活性受體提供的信息來區分自體健康細胞及外來的、受感染的或轉化的細胞。在血液中，細胞毒性CD56dimNK細胞和免疫調節CD56brightNK細胞構成了NK細胞的兩個主要群體。與T細胞相比，NK細胞具有以下優勢：NK細胞介導的細胞毒作用不受HLA限制；同種異體半相合NK細胞不會引起移植物抗宿主病[3,4]；減少了CAR靶向抗原丟失所致的復發或耐藥性風險[5,6]；此外，巨細胞病毒誘導的記憶樣適應性NK細胞已被證明是長壽和高效的[7]。綜上所述， NK細胞的安全性與抗腫瘤能力的結合使其成為CAR技術實施的一顆新星，通過基因修飾引入抗原特異性來增強NK細胞的抗腫瘤反應是目前腫瘤免疫領域研究的熱點之一。

2 NK細胞來源

2.1 NK細胞系(NK-92)

目前大多數CAR-NK細胞研究都是用NK-92細胞進行的，NK-92細胞最初來源于非霍奇金淋巴瘤患者中，其在IL-2的作用下激活增殖，在保持一致表型和功能特征的同時可大量擴增[8]。然而，NK-92細胞表面缺乏抑制性殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR) 及CD16的表達，因此不能通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC)殺傷靶細胞。通過基因工程將高親和力的CD16受體嵌合到NK-92細胞中有效解決了上述問題，以通過ADCC促進腫瘤消除[9]，但與CD16結合的腫瘤特異性單克隆抗體可能會受到患者體內IgG的競爭性結合。最近，將NK-92細胞與第四代CAR結構結合，稱為UniCAR[10]。UniCAR由針對多肽表位E5B9的胞外單鏈片段可變區、CD28跨膜和胞內共刺激結構域及CD3ζ胞內信號域組成，經修飾表達UniCAR的NK-92細胞可通過被稱為靶模塊(Testination Module，TM)的雙特異性靶分子重定向到腫瘤細胞。與表達CD16的NK-92細胞相比，UniCAR NK-92細胞只被攜帶E5B9肽表位的TM激活，提供了更高水平的選擇性和特異性。此外，通過同時或順序使用不同的TM，可將相同的CAR-NK細胞重定向到不同的靶細胞，從而實現了其針對靶抗原的高度靈活性[10]。盡管NK-92細胞受到較高的關注度，但因NK-92細胞來自淋巴瘤且有可能感染EB病毒，這使得細胞在輸注前必須進行照射[11]。大量研究表明，NK-92細胞在照射后仍保持其細胞毒性，但降低了其在體內的增值性[12]，需通過多次輸注進行治療。

2.2 臍血NK細胞

NK細胞的另一來源是臍帶血(CB)，15%-30%的CB淋巴細胞是NK細胞，通常認為它們在表型和功能上比外周血(PB)NK細胞更幼稚。CD16、顆粒酶B、穿孔素和殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)在臍血NK細胞中的表達性降低，細胞粘附分子CD2、CD11a、CD18和CD62L的表達也降低。有限的ADCC潛能和粘附分子的減少導致了臍血NK細胞的細胞毒性能力降低[13,14]。較高比例的臍血NK細胞是CD56bright，這導致抑制性受體NKG2A的總體表達增加，該受體的配體HLA-E通常在腫瘤細胞上表達上調，這與腫瘤預后不良相關[15]。因此，NKG2A是一個重要的免疫檢查點，在頭頸部鱗狀細胞癌的發生過程中，NKG2A已成為單克隆抗體治療的靶點，以促進NK細胞殺傷腫瘤的潛能[16]。與其未成熟特性相一致的是，臍血NK細胞具有較高的增殖能力，并且容易接受細胞因子的刺激。雖然臍帶血庫使臍血來源的NK細胞成為一種可行的起始產品，但從臍帶血中獲得的少量NK細胞需經多次細胞分裂，才能獲得足夠的細胞數量以供輸注[13]。盡管如此，臨床上的CAR-NK細胞產品已經有來源于臍血NK細胞的，目前正在臨床上進行測試[17]。

2.3 外周血NK細胞

大約90%的外周血NK細胞是具有細胞毒性的CD56dimNK細胞，表達大量的抑制性和激活性受體。與臍血NK細胞相比，外周血NK細胞更成熟，其功能更強，但增殖能力降低[18]。無論是在自體還是同種異體情況下，即NK細胞來自HLA匹配或不匹配的供者，以及KIR配體匹配或不匹配的供者，它作為一種過繼細胞治療產品的安全性已通過了大量臨床試驗的證明[19,20]。使用來自異體且HLA不匹配的外周血NK細胞的臨床試驗特性大大增加了可供選擇的捐贈者數量。將NK細胞分離是一種從健康捐贈者血液中提取有核細胞的方法，它有助于分離足夠數量的NK細胞，在輸注之前，通常會將這些細胞進一步擴增，并用IL-2或IL-15等細胞因子將其激活。雖然其在血液系統惡性腫瘤(主要是急性髓系白血病)的臨床結果很有希望，但臨床反應因患者而異，其臨床前的體外研究很難預測臨床試驗結局。

2.4 IPSC來源的NK細胞

誘導多能干細胞 (induced pluripotent stem cells，iPSC)來源的NK細胞是CAR-NK細胞產品的理想來源，因為其具有無限增殖的潛力[21]，只需要一個CAR轉導的IPSC細胞就可以產生通用的現成CAR-NK細胞產品。然而，IPSC來源的NK細胞的研究現處于初級階段，仍需克服許多挑戰才能生產出理想的現成產品。IPSCs通常來源于非造血細胞，與外周血NK細胞相比，其產生的NK細胞具有CD16、KIR低表達，NKG2A高表達的未成熟表型[22,23]。這就提出了一個問題，即當遇到靶細胞時，它們的細胞溶解能力是如何保持和釋放的，與NK-92細胞類似，通過基因工程使IPSC來源的NK細胞表達缺乏的表面蛋白(如CD16)是解決這一挑戰的有效方案。雖然它們的增殖能力是無與倫比的，但輸注后的持久性問題仍然存在，在IPSC來源的NK細胞的潛力被激發之前這些挑戰都需得到解決[24]。第一個IPSC衍生的CAR-NK細胞產品(FT596)表達CD19-CAR結構、高親和力的CD16Fc受體及IL-15受體融合蛋白，并與CD20導向的單克隆抗體聯合應用于實驗中。該產品不僅解決了IPSC來源的NK細胞有限的持久性及CD16低表達問題，同時還進行了聯合免疫治療試驗，其在CD19+淋巴瘤的人源化小鼠的研究中取得了令人振奮的臨床前研究結果，這為最近開始的I期臨床試驗(NCT04245722)鋪平了道路。

3 CAR-NK細胞的臨床試驗

目前ClinicalTrials數據庫收集了12項關于CAR-NK細胞的試驗，其中6項在積極招募中，6項I期臨床試驗尚未積極招募。關于CAR-NK細胞的試驗主要集中在淋巴瘤和白血病上，其次是針對實體腫瘤的，包括卵巢癌、前列腺癌、腦癌、肝癌、肺癌和胰腺癌。使用NK-92和初級靶向CD33或NKG2D的CAR-NK細胞的小規模臨床試驗(n=3)結果已被報道[25,26]，而在最近才發表出一項大規模的I/II期臨床試驗結果[17]。11例CD19陽性的復發難治性慢性淋巴細胞白血病(CLL)或非霍奇金淋巴瘤患者在接受標準的環磷酰胺/氟達拉濱去淋巴治療后，接受了臍血來源的CAR-NK細胞產品，其中8例患者(73%)得到緩解，7例(4例淋巴瘤，3例CLL)獲得完全緩解，1例Richter’s轉化的CLL獲得部分緩解，并且沒有出現細胞因子釋放綜合征、神經毒性、移植物抗宿主病等不良反應。在此試驗中，盡管輸注的NK細胞和受體之間存在嚴重的HLA不匹配，但輸注的CAR-NK細胞仍然擴張，并持續存在至少12個月，IL-15的加入可能在這些CAR-NK細胞的持久性和抗腫瘤活性中發揮了重要作用。

4 CAR-NK細胞的挑戰

目前，CAR-NK細胞在臨床的實施主要受到三個因素的限制，即NK細胞對基因工程的抵抗；NK細胞有限的增殖能力；輸注后的持久性有限。(1) 用逆轉錄病毒或慢病毒對原代NK細胞進行病毒轉導的效率很低，因此對NK細胞進行非病毒轉染方式(DNA或mRNA質粒的電穿孔)[27]受到了關注，但電穿孔在CAR構建體中只是瞬時表達，因此不是穩定的CAR-NK細胞基因工程產物的可行方法。現其他非病毒轉染方式即DNA轉座子[28]及靶向基因整合[29]的研究有望解決這一挑戰。(2)目前NK細胞的擴增通常依賴于超生理水平的細胞因子的誘導，通過將IL-15、IL-12和IL-18相結合，已經從小鼠和人NK細胞中獲取到細胞因子誘導的記憶樣NK細胞，其表現出更強的抗腫瘤反應性和持久性[30,31]。但IL-15可導致NK細胞在體外擴增時對細胞因子成癮，且呈劑量依賴性，因此當輸注擴增的初級NK細胞產品時，需要考慮細胞因子成癮問題[32]。(3)延長CAR-NK細胞持久性的一種方法是給予全身細胞因子支持，以誘導體內輸注產品的增殖，雖然IL-2和IL-15已經在臨床試驗中進行了測試，但兩者都會導致嚴重的副作用[33]。

5 結語

CAR-T細胞治療淋巴瘤的臨床成功促進了CAR-NK細胞領域的快速發展。FDA批準的第一個轉基因細胞產品為CAR-NK細胞的臨床應用鋪平了道路，但簡單地將針對T細胞的優化結構整合到NK細胞中并不是最理想的，且導致細胞活化的生物學分子機制在T細胞和NK細胞之間有很大的差異，因此需進一步考慮如何設計CAR-NK細胞的結構。新方法的開發和現有技術的優化將促進對原代NK細胞進行更有效的基因工程改造，使新一代NK細胞能夠取代目前正在臨床上測試的NK-92細胞產品。最后，無論是進一步開發基因構建工程，還是尋找最佳NK細胞來源，如果能夠解決持久性問題，CAR-NK療法作為一種新的抗癌免疫療法將具有巨大的潛力。