Spred蛋白及其相關miRNA研究進展

龔堅 劉巧

1江西中醫藥大學（南昌330004）；2江西中醫藥大學第二附屬醫院（南昌330012）

Spred 家族是一組Sprouty 相關的酪氨酸激酶結合蛋白，目前哺乳動物中有Spred-1、Spred-2、Spred-3 和Eve-3 四個家族成員，廣泛存在各種生物組織中；其家族成員主要由N 末端的EVH1（Enabled/VASP homology-1），中部的KBD（Thec-Kit bindingdomain）和C 末端的SPR（Sprouty-relateddomain）三個結構域組成，不同結構域影響不同的生物學功能［1-3］。Sped 蛋白對多種生長因子誘導的Ras-ERK 信號途徑有負調控作用，參與腫瘤的轉移、血管增生修復、免疫調節等生理病理過程。microRNA（miRNA）是一種非編碼性單鏈小分子RNA，廣泛存在于生物細胞中，可與靶基因mRNA的3′非編碼區（3′-UTR）結合形成沉默復合體，然后導致靶基因mRNA 降解或抑制靶基因的翻譯，進而調控靶基因的表達；與細胞增殖、分化、器官形成以及免疫應答過程等都息息相關［4］。研究表明，Spred 是多種miRNA 的靶蛋白，它們能通過調節Spred 蛋白表達，參與多種疾病進程中。本文就近年Spred 蛋白及其相關miRNA 研究進展作一綜述。

1 Spred 蛋白信號傳導及生物學功能

1.1 Spred蛋白與Ras/MAPK信號通路Ras/MAPK信號通路在細胞信號轉導過程中起著極為重要的作用。WAKIOKA 等［1］通過細胞實驗首次證明Spred 蛋白家族對于Ras/MAPK 信號通路抑制作用，但是其具體結合靶分子尚不明確；隨著近年對Spred 蛋白研究的增多，越來越多的證據表明Spred蛋白家族是Ras/MAPK 信號通路抑制劑；在細胞表面整合素、FGF 受體、細胞因子受體等酪氨酸激酶受體受到刺激后，胞內蛋白質如SHC、GRB2 和SHP2 被激活并募集細胞質中SOS，后者促使GDPRas 轉化為GTP-Ras，即RAS 蛋白被磷酸化激活；GTP-Ras 募集Raf-1 激酶并使Raf-1 磷酸化，后者進而激活Erk 等在內的下游蛋白［5］；在這一過程中Spred 能特異性地增強激活的Ras 和Raf 之間的相互作用，形成復合體，抑制Raf 活化，繼而抑制下游通路的激活［1］。

1.2 Spred 蛋白生物學功能Erk1/2 激酶活化是T 細胞中幾種生長因子的信號級聯中的關鍵事件，它也是在T 細胞受體（TCR）信號傳導途徑，導致T 細胞的活化和增殖的下游事件；腫瘤微環境中高水平的TGF-β可導致上游TCR 信號傳導組分的下調，同時伴隨著Spred-1 的上調，這些結果導致Erk途徑的抑制，從而導致腫瘤浸潤性CD8+T 細胞的增殖/細胞因子產生受損，可見Spred 蛋白與腫瘤細胞免疫抑制密切相關［6］。在對Spred-2 KO 小鼠研究中發現，該類小鼠表現出學習缺陷、抑郁以及類似強迫癥行為，如皮膚敏感、強迫性自我修飾等，進一步研究表明Spred-2 缺乏導致小鼠杏仁核中原肌球蛋白受體激酶B（TrkB）、Ras 和Erk 活性的增加介導了通路的過度激活誘發，并且該途徑失調會導致突觸前、后mRNA 和蛋白質的變化以及丘腦-杏仁核傳遞的改變；這一結果表明，Spred-2 可能是不同大腦區域突出傳遞的關鍵調節劑［7］。心臟功能取決于平衡的蛋白質更新，因此，調節蛋白衰減對于維持心臟功能至關重要。研究表明，Spred-2-/-小鼠表現出心肌細胞肥大，心臟纖維化，電興奮性受損和嚴重的心律失常。其機制可能是Spred-2 缺失，導致心肌細胞中自噬相關介質失調及Erk 過度活化，繼而引起心肌細胞功能異常，最終導致心臟功能障礙；由此可見Spred-2 參與心肌細胞自噬功能及調節心臟功能的過程［8］。除上述生物學功能外，近年研究表明Spred 蛋白還參與了腫瘤細胞增殖、分化，腫瘤侵襲、轉移，血管增生及修復，細胞自噬，肺臟發育，骨生長，淋巴管生成等多種生理病理過程。

2 Spred-1 蛋白與miRNA

研究表明，在小鼠胚胎中，Spred-1 蛋白在心、肝、肺、腦組織有強表達，說明Spred-1 對胚胎發育有重要作用；而在成熟小鼠中Spred-1 蛋白主要在大腦中表達最強，小鼠肺、心臟、肝、腎、腸、脾、睪丸、胸腺和卵巢等組織中也能觀察到Spred-1 的表達，進一步研究發現Spred-1 與這些臟器的多種疾病密切相關［9］。miRNA 作為非編碼RNA，在對研究發病機制愈發重要，而其具體機制尚不完全清楚。目前發現，多種miRNA 調控因子通過調控Spred-1 蛋白，繼而參與的疾病的發生發展。

2.1 miR-126miR-126 是由表皮生長因子樣結構域7（EGFL7）基因的內含子7 編碼的miRNA，主要在血管內皮細胞（EC）中表達，包含miR-126-3p和miR-126-5p 兩條成熟鏈［10-11］。EC 表達的miR-126 可以激活VEGF 依賴的信號通路并促進血管生成及調節血管完整性，在這一過程中Spred-1 作為miR-126-3p 靶蛋白發揮重要作用［12-13］；因此，miR-126 通過調節Spred-1 蛋白參與和血管增生、修復等相關疾病，如心腦血管疾病、腫瘤、肺部疾病、糖尿病血管病變、眼部血管相關疾病等。

在心肌梗死老鼠模型的研究中發現，心肌梗死老鼠心肌組織中miR-126 表達明顯降低，但通過丹參紅注射液干預治療后miR-126 表達升高，同時抑制了Spred-1 表達，并激活了ERK 途徑，促進了血管生成作用，達到修復心肌的作用［14］。缺血性卒中是全世界死亡和殘疾的主要原因之一，血管生成被認為是缺血性中風后修復和重塑的有希望的療法［15］。miRNA 分析研究揭示miR-126 在年輕卒中患者中下調［16］；而在短暫性腦缺血發作（TIA）的研究中發現，在TIA 發病3 h 內miR-126 開始下降，到12 h 顯著低于健康人，而Spred 則相反，二者呈現明顯時間相關性；進一步實驗發現，TIA發作后隨時間延長外周血（VEGF）濃度逐漸升高，這些結果提示在TIA 中miR-126 調控Spred-1 表達參與VEGF 信號通路對內皮細胞及血管修復中［17］。病理性視網膜新生血管（RNV）是眼科疾病視力喪失的主要原因之一，而研究表明miR-126 和Spred-1可能作為治療RNV 相關眼病的新型分子靶標，其機制是在RNV 的發展過程miR-126 可通過抑制Spred-1 表達來促進誘導性多功能干細胞（IPS 細胞）中VEGF 的表達，進而有助于血管生成［18］。有研究表明，miR-126、Spred-1 參與白血病、肝癌、胃癌、肺癌、膠質瘤等多種腫瘤的發生；如在經導管動脈化療栓塞（TACE）后肝細胞癌（HCC）模型中，通過抑制miR-126 的表達水平促進Spred-1 的表達，可抑制VEGF 通路調節TACE 后HCC 患者血管生成［19］；可見miR-126、Spred-1 在腫瘤發生及治療中均重要作用。

2.2 miR-212 及miR-132/212miR-212 和miR-132 基因以相同的結果存在于生物組織，與神經功能、腫瘤、免疫調節等功能密切相關［20］。研究發現，大鼠紋狀體中的miR-212 在接觸可卡因10 d 后開始增加，并持續存在；其機制可能是miR-212 介導的Spred-1 表達抑制進而促進Raf-1 激活擴增CREB 信號，從而調節可卡因攝入的效應［21-22］。在miRNA-132/212 KO 的股動脈閉塞動物模型的研究中發現灌注恢復現象，說明miR-132/212 參與該模型動脈生成過程，而進一步實驗表明，miR-132/212簇是通過直接靶向其抑制劑Rasa1 和Spred-1 調節Ras-MAPK 信號傳導來促進動脈發生［23］。以上研究表明，Spred-1 是miR-212 及miR-132/212 參與藥物成癮及動脈發生的重要調控因子。

2.3 miR-196amiR-196a 是由HOX 家族基因轉錄而來，不僅參與調節脂肪分布、干細胞細胞分化等生物學過程，而且還在食管癌、乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌等腫瘤的發生發展中發揮類似癌基因的功能［24］；國內學者在對乳腺癌研究中發現，Spred-1 是miR-196 的直接靶標，它通過抑制c-Raf 信號通路在miR-196a 促進BC 細胞增殖，遷移和侵襲中發揮關鍵作用；進一步實驗發現，雌激素受體（ER）可調控的miR-196a，進而調節Spred-1 蛋白表達，最后影響腫瘤生長和血管生成；結果表明，miR-196a 及其靶標Spred-1 在雌激素介導的乳腺癌進展中發揮重要作用，這可能有助于為乳腺癌提供新的治療靶點［25］。

2.4 其他除上述miRNA 外，miR-1、miR-21、miR-144、miR-182、miR-206、miR-409 均能靶向Spred-1 蛋白表達，參與疾病發生。研究表明，miR-1 是心肌梗死早期敏感標志物；當心肌梗死發生后，miR-1 表達升高促使人類來源的心肌細胞祖細胞（hCMPCs）被誘導分化為內皮細胞和平滑肌樣細胞，從而在體外形成血管網絡，幫助完成心肌梗塞后心肌修復；在這過程中過表達的miR-1 抑制Spred-1 表達，從而減輕Spred-1 對由促血管生成生長因子激活的細胞內信號級聯反應的抑制作用，進而完成血管重建工作；可見miR-1 在心肌梗死早期及后期修復中均有重要作用［26-27］。miR-144、miR-182、miR-206/21 在調節各種癌癥中的細胞增殖，克隆形成，遷移，侵襲和腫瘤形成中起重要作用；SHARMA等［28］研究發現Spred-1 是miR-144新的靶標，在69%食道癌（EC）組織中下調，而且65%的食管癌組織中觀察到Spred-1 mRNA 水平與miR-144表達呈負相關；而在惡性口腔癌組織中，通過持續上調miR-182抑制Spred-1表達，促使Ras/Raf/Erk信號傳導激活并促進癌細胞增殖［29-30］。在三陰性乳腺癌細胞中，miR-206/21 協作通過抑制RASA1和Spred-1 的翻譯來促進RAS-Erk 信號傳導和相應的細胞表型表達［31］。鄭劍等［32］通過對三氯乙烯藥疹樣皮炎（OMLDT）患者血清研究發現，miR-409 在OMLDT 患者中具有差異表達，其可能靶向調節Spred-1 的表達，通過下調MAPK 信號通路，造成三氯乙烯藥疹樣皮炎患者的肝損傷。

3 Spred-2 蛋白與miRNA

Spred-2 蛋白在人體各種組織及成熟大鼠的各種組織中廣泛表達，包括消化道、肺、腎和肝［33］；在疾病研究中，組織廣泛表達的Spred-2 蛋白正作為多種miRNA 的調控靶標備受重視。

3.1 miRNA-487amiR-487a 定位于14 號染色體，在調節癌癥遷移中起作用；有報道其參與乳腺癌［34］、前列腺癌［35］等腫瘤發生。而在肝細胞癌中，CHANG 等［36］研究發現，Spred-2 是miR-487a 的直接靶標，并且miR-487a 可通過與Spred-2 mRNA 的30-UTR 的2527-2549 位點和2575-2597 位點結合來抑制Spred-2 表達；進一步實驗表明，上調miR-487a通過調節HCC 細胞中miR-487a 介導的MAPK 信號傳導促進肝癌細胞轉移；說明miR-487a 和Spred-2可成為肝細胞癌的潛在治療靶點。

3.2 miR-210miR-210 是一種由HIF-1α調節的缺氧反應性microRNA，廣泛參與血管生成、腫瘤發生等生理病理過程［37-38］；Spred-2 是其50 余個靶基因中之一，被認為是miR-210 參與頸動脈粥樣硬化、中風和胃腸道腫瘤調控靶基因。氧化低密度脂蛋白（oxLDL）是導致心血管疾病（CVD）和消化道腫瘤的常見致病因素，研究發現，oxLDL 誘導的miR-210 可以增 強Spred-2/ERK/c-Fos/MMP 信號傳導，繼而參與腫瘤細胞增殖和遷移；而使用異種移植小鼠模型和喂食高脂肪飲食的ApoE KO 小鼠的動物研究進一步支持了oxLDL、miR-210、Spred-2與腫瘤、動脈粥樣硬化、中風的關系［39］。

3.3 其他Spred-2 是miR-1246、miR-221 和miR-485-3p 靶基因之一，但在不同疾病中表達。在一項結直腸癌的實驗研究中抗癌基因Spred-2 被鑒定為miR-1246 的下游靶標，而進一步實驗發現，類甲基轉移酶3（METTL3）可以甲基化pri-miR-1246，促進pri-miR-1246 的成熟，進而通過MAPK 通路促進體內外腫瘤細胞的轉移活動，這一發現為腫瘤提供了新的治療靶點［40］。在小兒哮喘和其他不同的哮喘表型中，多種miRNA 表達失調，其中miRNA-221 和miRNA-485-3p 表達上調，Spred-2 蛋白水平表達下調［41］；而研究表明，在小兒哮喘及哮喘小鼠模型中，Spred-2 是miRNA-221 和miRNA-485-3p 的預測靶標，上調miRNA-221 和miRNA-485-3p抑制Spred-2 mRNA 表達，繼而參與過敏原誘導的氣道炎癥和高反應性［42］。由此可見，多miRNA 調控的Spred-2 在疾病發生、發展中有重要作用。

4 Spred-1/2 蛋白與miRNA

Spred-1、Spred-2 可共同表達于多種動物組織及人體組織中，如肺、腦等組織中，部分miRNA 能通過調控這兩種蛋白參與疾病進程中。有研究表明，Spred-1、Spred-2 均是miR-31 靶蛋白；在對在人和小鼠肺癌的實驗研究中發現，miR-31 表達增加，而miR-31 的4 種靶蛋白Spred-1、Spred-2、RASA1 和SPRY4 減少，且前后者之間存在顯著的負相關，其機制可能是miR-31 升高抑制Spred-1、Spred-2 表達，繼而導致Erk 活化增加，導致肺腫瘤細胞增殖增加；這種情況在肺腺癌中更突出［43-44］。同樣，在表皮修復過程中，miR-31 通過靶向Spred-1、Spred-2等Ras/MAPK 信號通路的負調控因子從而激活Ras/MAPK 信號通路，繼而通過該通路完成傷口周圍細胞增殖和細胞遷移，加快損傷組織的修復［45］；由此可見miR-31 通過靶向Spred-1、Spred-2 參與部分疾病。

5 結語與展望

綜上所述，部分miRNA 通過調控Spred 蛋白表達參與腫瘤細胞增殖、轉移，血管增生修復，氣道炎癥及高反應性，損傷組織修復等等病理生理過程，進而參與多種疾病發生發展。隨著探索的深入，相信會有更多的miRNAs 被證明在疾病中調節Spred 蛋白的表達，這對于完善miRNA 參與疾病發生的機制大有裨益。目前，在多基因、多miRNA、網絡式立體的研究疾病的現在，Spred 蛋白及其相關miRNA 的基礎研究取得了一定成果，特別是在腫瘤及心腦血管疾病方面，然而少有基礎研究上的臨床研究及應用研究；因此，如何探索、建立Spred 蛋白及其相關miRNA 對疾病調控網絡的研究以及在優勢病種方面的臨床研究及成果轉化應是下一步研究方向。