黑龍江省某牛場多種病原混合感染病例的實驗室診斷

王浩先，王世界，王祥玉，倪宏波

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163000； 2.青島農業大學動物醫學院)

近年來，牛病的種類相對增多，且發展趨勢向著疑難雜癥轉變[1-2]，其中以牛的呼吸道、胃腸道疾病為典型，往往也是最易造成牛的死亡，其極高的發病率，也為牛場帶來了嚴重的經濟損失[3]。

本實驗根據黑龍江省杜蒙烏力吉圖某奶牛場的流行病學調查和送檢的2份病料進行PCR病原鑒定和細菌分離鑒定，在此基礎上進行了藥敏試驗。現將診斷過程及結果總結如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料 烏力吉圖奶牛場送檢的2份從心、肝、脾、肺、腎、淋巴結、各處黏膜采集的樣本存放于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2實驗方法

1.2.1樣本的處理 取每個組織樣本1 g混合于玻璃研磨器中，加入DEPC水2 mL，研磨至樣本均勻。倒出研磨液，稀釋至肉粉色(或無明顯血液)達到合理濃度。

用同樣方法取每個組織樣本1 g于玻璃研磨器中用生理鹽水稀釋一遍做細菌培養試驗。

1.2.2細菌分離培養 將處理后的兩份樣本在血瓊脂平板上進行劃線培養(37 ℃,24 h)，觀察細菌菌落生長情況，隨后涂板進行藥敏實驗。

1.2.3藥敏實驗 挑取細菌菌落用生理鹽水制成菌液均勻涂于血平板上，用上述藥片進行藥敏實驗。

1.2.4菌樣樣本DNA/RNA的提取 提取菌樣樣本DNA采用天根(TIANGEN)TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)。

提取菌樣樣本RNA采用天根(TIANGEN)RNAsimple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒(離心柱型)。

依據DNA/RNA提取試劑盒使用說明書按步驟進行操作提取所需菌樣樣本DNA及RNA。

1.2.5十三對PCR引物及其反應條件 各病原各自對應的引物序列及退火溫度如表1所示。其所需的反應條件及其所需的反應參數如表2所示。

表1 十三對PCR引物及其反應條件

表2 PCR反應程序

2 結果

2.1藥敏實驗結果 藥敏試驗結果顯示：1號病料樣本對鹽酸林可霉素敏感，對鏈霉素、恩諾沙星中度敏感，對硫酸慶大霉素有耐藥性；2號病料樣本對鏈霉素敏感，對鹽酸林可霉素、恩諾沙星中度敏感對氟苯尼考有耐藥性，詳細結果如表3所示。

表3 藥敏試驗結果

2.2SS鑒別培養基實驗結果 如圖1所示，經SS瓊脂培養基培養鑒定，培養鑒定出粉紅色大腸桿菌菌落，無黑色沙門氏菌菌落。

2.3PCR實驗結果 將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用紫外凝膠成像分析儀攝像核酸電泳凝膠成像，其結果如圖2所示。1號病料樣本檢測出的致病病原為：魏氏梭菌α、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏桿菌病、多殺性巴氏桿菌、牛化膿隱秘桿菌、牛冠狀病毒和牛輪狀病毒。2號病料樣本檢測出的致病病原為、魏氏梭菌α、牛傳染性鼻氣管炎、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏桿菌病、多殺性巴氏桿菌和牛化膿隱秘桿菌，詳細結果如表4所示。

圖1 SS瓊脂培養基鑒定

注：M代表marker，M左側1-13為1號混合病料檢測；右側1-13為2號混合病料檢測。圖2 兩份病料PCR結果圖

表4 PCR結果表

3 討論

本實驗通過檢測兩例混合病料檢出：1號病料其主要致病病原為大腸桿菌、魏氏梭菌α、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏桿菌病、多殺性巴氏桿菌、牛化膿隱秘桿菌、牛冠狀病毒和牛輪狀病毒。2號病料其主要致病病原為大腸桿菌、魏氏梭菌α、牛傳染性鼻氣管炎、牛克雷伯氏菌、牛溶血性曼氏桿菌病、多殺性巴氏桿菌和牛化膿隱秘桿菌。

藥敏實驗結果表明1號樣本對鹽酸林可霉素敏感，對鏈霉素、恩諾沙星中度敏感，對硫酸慶大霉素有耐藥性；2號樣本對鏈霉素敏感，對鹽酸林可霉素、恩諾沙星中度敏感對氟苯尼考有耐藥性。分離出的細菌主要是條件致病菌和環境致病菌，因此要保持牛場環境的污染小，并減少外界環境對牛的刺激，以免應激后增加發病率。當本牛場出現以呼吸道和消化道疾病為主要特征的病例時，可首選鏈霉素和鹽酸林可霉素作為治療藥物，并采取隔離措施，對類似情況有一定指導意義。由于耐藥性的存在，在治療中應使用多種敏感藥物聯合或交替使用，以減少單一藥物的劑量或使用時間以達到更好的治療效果[4-6]。

近幾年國內外牛呼吸系統疾病頻發，有國外的學者將由支原體和多種細菌或病毒引起的牛肺炎、支氣管炎、運輸熱等統稱為牛呼吸道疾病綜合征，該類病癥會對牛養殖業造成巨大的經濟損失，因此我國采取了重大動物疫病強制免疫措施，以從源頭上預防并控制疾病，且已經取得了不錯的效果。由此可見現階段對細菌性病原的致病機理和防控技術研究具有重大意義[7-9]。

本病例雖未檢出牛腹瀉黏膜病毒，但牛病毒性腹瀉病在牛群養殖的過程中常見，且極易流行，各個年齡段的牛都容易受此病毒的感染，特別是犢牛，一旦發作便會導致急性牛病，臨床特征常以發熱且嚴重腹瀉，并且其排泄物當中都含有此類病毒，因此牛舍的環境對該病的傳染有十分巨大的影響，要做到及時清潔保持牛舍的比較干凈、干燥舒適的環境[10-12]。