四川省生豬屠宰企業(yè)非洲豬瘟檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及生物安全技術(shù)要求

1 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)要求

1.1 實(shí)驗(yàn)室布局 遠(yuǎn)離生產(chǎn)區(qū)，處于相對(duì)封閉區(qū)域。實(shí)驗(yàn)室面積需滿足工作需要，原則上不低于30 m2，至少包括獨(dú)立的前處理室和檢測(cè)室。前處理室面積原則上不低于20 m2，檢測(cè)室面積原則上不低于10 m2。前處理室應(yīng)分為樣品處理區(qū)、配液區(qū)等，嚴(yán)格分區(qū)操作。

1.2 主要儀器設(shè)備及耗材配置

1.2.1 前處理室主要儀器設(shè)備 配置離心機(jī)、高壓滅菌鍋、渦旋振蕩器、水浴鍋（金屬浴）、移動(dòng)紫外燈、移液器及其配套吸頭（樣品處理區(qū)和配液區(qū)各一套移液器，不能混用），配備冷藏冷凍冰箱（存放檢測(cè)試劑、檢測(cè)樣品、滅菌后廢棄物）、儲(chǔ)物柜（存放EP管、PCR管、槍頭等耗材）、垃圾桶2個(gè)（1個(gè)配黑色垃圾袋，用于盛放普通垃圾；1個(gè)配黃色廢棄物專用垃圾袋，用于盛放廢棄物）。

1.2.2 檢測(cè)室儀器設(shè)備 熒光定量PCR 儀或其他檢測(cè)設(shè)備。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)耗材 采血器（或注射器）、真空采血管（EDTA 抗凝劑）、1.5 mL EP 管及其管架、PCR八聯(lián)管（與熒光PCR 儀配套）及其管架、剪刀、鑷子、搪瓷托盤、酒精燈等。

1.2.4 其他器材 實(shí)驗(yàn)臺(tái)、操作椅、試劑架、器皿櫥等。

1.2.5 個(gè)人防護(hù)用品 實(shí)驗(yàn)服、一次性乳膠手套、一次性口罩、一次性鞋套。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員 屠宰企業(yè)應(yīng)配備專職檢測(cè)技術(shù)人員，并接受實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)及生物安全相關(guān)知識(shí)培訓(xùn)，熟悉非洲豬瘟檢測(cè)要求。

2 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范

2.1 樣品采集 生豬屠宰企業(yè)應(yīng)安排專人負(fù)責(zé)樣品采集，并填好采樣記錄表。樣品為生豬抗凝血（5 mL，0.5%EDTA 抗凝，不能使用肝素鈉作為抗凝劑）或全血樣品。

2.2 樣品保存 樣品采集后，按要求進(jìn)行混血，混血待檢樣品需在60 ℃下進(jìn)行30 min 的滅活處理，在12 h 內(nèi)檢測(cè)的待檢樣品應(yīng)在冰箱冷藏（4 ℃）保存，超過12 h 不能檢測(cè)的樣品和留樣需冷凍保存。留樣應(yīng)至少保存3個(gè)月，以備復(fù)查。

樣品需轉(zhuǎn)運(yùn)的，應(yīng)按農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動(dòng)物病原微生物菌（毒）或者樣本運(yùn)輸包裝規(guī)范》要求進(jìn)行包裝，并由專人將樣品送至實(shí)驗(yàn)室，禁止使用公共交通工具運(yùn)送。

2.3 樣品檢測(cè)

2.3.1 嚴(yán)格按照試劑說明書的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.2 采集的血液樣品，可按照生豬批次（車次）或一定的生豬數(shù)量進(jìn)行混樣，具體混樣數(shù)量根據(jù)所使用的檢測(cè)試劑盒的技術(shù)指標(biāo)科學(xué)確定。

2.3.3 待檢血樣必須充分混勻，使用經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)或中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心對(duì)比符合要求的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.4 熟悉操作，縮短檢測(cè)過程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞。

2.3.5 所有試劑開蓋前都應(yīng)先瞬時(shí)離心，避免液體飛濺；若液體不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并清潔桌面。

2.3.6 樣品處理、配液、擴(kuò)增嚴(yán)格分區(qū)操作，儀器、耗材等嚴(yán)禁交叉混用。

2.3.7 加樣時(shí)嚴(yán)禁反復(fù)吹吸。

2.3.8 熒光探針應(yīng)避光保存，反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用，加入核酸后應(yīng)盡快上機(jī)。

2.3.9 不要在熒光定量PCR 管蓋的采光部位做任何標(biāo)記。

2.4 原始記錄 檢測(cè)完成后應(yīng)填寫并保存相關(guān)檢測(cè)原始記錄，檢測(cè)原始記錄、PCR圖至少保存2年。

2.5 檢測(cè)報(bào)告 根據(jù)《關(guān)于全面開展生豬屠宰環(huán)節(jié)非洲豬瘟檢測(cè)工作有關(guān)具體要求的通知》（川動(dòng)監(jiān)〔2019〕5號(hào)）要求，屠宰企業(yè)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)規(guī)范出具《檢測(cè)報(bào)告》，載明對(duì)應(yīng)的檢疫合格證明編號(hào)、檢測(cè)方法、檢測(cè)日期、檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)報(bào)告必須經(jīng)由報(bào)告編制人、駐場(chǎng)官方獸醫(yī)和批準(zhǔn)人（場(chǎng)點(diǎn)負(fù)責(zé)人）簽字確認(rèn)，加蓋屠宰企業(yè)公章方為有效。檢測(cè)報(bào)告一式兩份，一份交駐場(chǎng)官方獸醫(yī)存檔，一份為屠宰企業(yè)自行留存，保存期至少2年。

2.6 結(jié)果處理

2.6.1 檢測(cè)結(jié)果為陰性，則同批生豬產(chǎn)品可以上市銷售。

2.6.2 檢測(cè)結(jié)果為陽性，應(yīng)立即停止生產(chǎn)，將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告駐場(chǎng)官方獸醫(yī)，并及時(shí)將陽性樣品送所在縣級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，待復(fù)核后再做處理。復(fù)核為陽性的按照《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實(shí)施方案（2020年版）》的規(guī)定進(jìn)行應(yīng)急處置。

3 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求

3.1 采樣生物安全

3.1.1 正確穿戴好口罩、手套、鞋套、實(shí)驗(yàn)服等個(gè)人防護(hù)用品。

3.1.2 盡可能使用物理設(shè)備保定動(dòng)物，既保證人的安全，又保證樣品質(zhì)量。

3.1.3 一頭豬一個(gè)注射器或一個(gè)真空采血管，避免樣品交叉污染。

3.1.4 采樣結(jié)束，采樣人員脫去個(gè)人防護(hù)用品，并對(duì)采樣環(huán)境進(jìn)行清潔消毒。

3.2 檢測(cè)過程中的生物安全

3.2.1 檢查樣品外包裝有無損壞，并對(duì)外包裝進(jìn)行消毒。

3.2.2 注射器使用完后必須放置于專用廢棄盒中待高壓滅菌處理，高壓滅菌前不得拆卸針頭和注射器。

3.2.3 盡量使用帶濾芯的移液器吸頭，不用移液器混勻液體。

3.2.4 對(duì)于管壁上沾有懸液的離心管，應(yīng)短暫離心后再打開管蓋。

3.2.5 核酸提取完成后應(yīng)先更換手套再進(jìn)行配液。

3.2.6 配液區(qū)和核酸提取區(qū)嚴(yán)格分開，儀器、耗材等嚴(yán)禁交叉混用。

3.3 檢測(cè)后實(shí)驗(yàn)室的消毒

3.3.1 實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面、桌椅、櫥柜、門把手、水龍頭等物品的表面可用有效氯濃度為0.1%～0.5%的消毒劑噴灑，作用30 min后用清水擦拭。

3.3.2 實(shí)驗(yàn)室地面可用有效氯濃度為0.1%～0.5%的消毒劑噴霧或拖地，各實(shí)驗(yàn)室拖把應(yīng)專用，不得混用。

3.3.3 廢液缸、剪刀、鑷子等可回收物，用消毒液浸泡30 min后用清水清洗，可高溫滅菌的用牛皮紙等包好后高壓（121 ℃，20 min）滅菌備用。

3.3.4 實(shí)驗(yàn)服等可重復(fù)利用的棉織制品，可經(jīng)121 ℃、20 min高壓滅菌、清洗后使用；也可用氯化物、酚化物等消毒劑浸泡30 min，清水清洗后晾干備用。

3.3.5 離心機(jī)、PCR 儀等儀器設(shè)備的金屬部件使用75%乙醇擦拭消毒，非金屬部件使用含2.3%有效氯的次氯酸鹽消毒30 min，然后清水洗凈或擦拭。

3.4 廢棄物處理

3.4.1 以下廢棄物需進(jìn)行高壓滅菌處理：超過留存期的所有樣品；使用后的槍頭、EP 管、采血管等；一次性個(gè)人防護(hù)用品，如口罩、手套、鞋套等；注射器針頭等銳器使用后應(yīng)直接棄置于耐高壓、防穿透的容器內(nèi)。將上述廢棄物放入醫(yī)療廢物袋，并在廢物袋的中心位置放置高壓指示帶或化學(xué)指示卡，袋口應(yīng)稍微扎緊（不能太緊），袋口和外表面噴灑消毒劑，121 ℃高壓滅菌處理20 min，然后將滅菌后的廢棄物存放在指定冰柜中，定期交由有資質(zhì)的無害化處理企業(yè)進(jìn)行無害化處理。

3.4.2 使用后的PCR 反應(yīng)管（內(nèi)含反應(yīng)產(chǎn)物）直接棄置于醫(yī)療廢物袋中，禁止開蓋（以免造成氣溶膠污染），交由有資質(zhì)的無害化處理企業(yè)進(jìn)行無害化處理。