接種牛糞菌系對稻秸發(fā)酵特性及固液相菌群的影響*

鄧玉營，黃振興，阮文權，郝衛(wèi)強

（1.常州工程職業(yè)技術學院，江蘇 常州 213164；2.江南大學環(huán)境與土木工程學院，江蘇 無錫214122）

1 引言

厭氧發(fā)酵被認為是農作物秸稈資源化的重要途徑之一，但秸稈結構復雜，水解過程被稱為厭氧發(fā)酵的限速步驟。因此，高效接種物有利于提高稻秸發(fā)酵效率，常見接種物包括沼液沼渣、堆肥、活性污泥等［1］。單一秸稈原料含氮量低，無法滿足厭氧微生物營養(yǎng)需要，導致其降解效率不高，因此在工程應用中，常添加畜禽糞便等來提高秸稈產甲烷效率，研究大多關注共發(fā)酵原料配比［2］、C/N 調控［3-4］、提高接種量［5］等。產甲烷酶活性及菌群結構的變化等指標有利于揭示體系發(fā)酵效率提高的機制。如在豬糞和玉米秸稈共發(fā)酵試驗中，甲烷菌群豐度的提高是甲烷產率強化的關鍵［6］。Wang 等［7］通過菌群結構分析了豬糞和玉米秸稈共發(fā)酵中與微生物的相互作用，結果發(fā)現(xiàn)，單一原料發(fā)酵菌群結構易受到揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs） 的影響，協(xié)同作用下降；添加豬糞提高了甲烷絲菌屬（Methanosaeta）的相對豐度，從而提高了甲烷產率。在豬糞與稻秸共發(fā)酵試驗中，接種量提高改變甲烷菌群結構，從而提高了甲烷產率［8］。在牛糞與玉米秸稈序批式共發(fā)酵試驗中，工藝操作通過改變細菌結構發(fā)揮作用；但甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina） 受影響較小，與產甲烷效率正相關［5］。由此可見，畜禽糞便中含有的菌系是提高秸稈厭氧共發(fā)酵效率的關鍵［4］，然而只將牛糞菌系作為接種物來研究菌群結構對稻秸發(fā)酵體系影響的報道并不多。

秸稈整個發(fā)酵過程是固液相微生物共同作用的結果。固相上水解菌群的變化，會導致酶活性的差異，影響秸稈結構的降解［9-10］。水解后產生的VFAs 進入液相，能通過互營氧化產生乙酸、氫等，該過程的氧化菌主要隸屬于互養(yǎng)菌門、厚壁菌門和變形菌門［11］，產物最終被甲烷菌所利用。然而除了對豬糞與小麥秸稈共發(fā)酵過程沼渣沼液中微生物變化有過研究外［12］，很少有通過固液相菌群分析揭示秸稈發(fā)酵機制的報道。

為此，本研究設計牛糞菌系接種的批次試驗，對稻秸厭氧發(fā)酵特性進行評價，分析產甲烷量分別與水解酶活性、單個VFAs 濃度變化之間的關系。并利用MiSeq 測序技術，分析固液相微生物結構特征，討論特定功能種屬變化對秸稈水解、發(fā)酵產酸、互營氧化及產甲烷的影響。以期為牛糞菌系接種稻秸發(fā)酵過程中微生物強化機制研究提供參考。

2 材料與方法

2.1 接種物和原料

接種污泥取自處理餐廚垃圾的厭氧反應器中，通過連續(xù)投加少量葡萄糖活化，提高產甲烷活性。總固體（total solids，TS） 質量分數(shù)為14.80%，揮發(fā)性固體（volatile solid，VS） 質量分數(shù)為6.65%。新鮮牛糞取自奶牛養(yǎng)殖場，為了減少對稻秸成分測定及產氣的影響，通過兩層紗布濾掉固渣后獲得牛糞菌系，TS 質量分數(shù)為15.97%，VS 質量分數(shù)為13.68%。稻秸在50 ℃干燥箱中烘至恒量，粉碎后過40 目篩，TS 和VS 分別為98.46%和91.58%，保存于真空干燥袋中備用。

2.2 試驗設計

接種污泥、牛糞菌系和稻秸的質量分數(shù)分別為8%、2%和2%，對照中不添加牛糞菌系。因為接種物沒有經(jīng)過脫氣處理，分別設置了不投加稻秸原料的空白試驗。體系利用改進的BY 提供金屬營養(yǎng)元素［13］，主要包括1.00 mg/L FeSO4·7H2O、1.00 mg/L CoCl2·6H2O、0.30 mg/L NiSO4·6H2O 等微量元素。添加K2HPO4·3H2O（1.34 g/L）、KH2PO4（0.51 g/L） 和NaHCO3（5.00 g/L） 組成緩沖體系，使初始pH 維持在6.8～7.1。

試驗分別在厭氧瓶和甲烷潛力測試系統(tǒng)（AMPTS） 中進行，有效體積分別為80、250 mL，39 ℃條件下發(fā)酵44 d。每個體系設置11 個厭氧瓶作為平行試驗，沼氣通過鋁箔袋收集。每隔4 d 各取1 個厭氧瓶，沼液用于水解酶活性、VFAs、pH指標測定，沼渣用于計算干基質量降解率。AMPTS 系統(tǒng)產生的沼氣通過4 mol/L 氫氧化鈉溶液吸收后測量甲烷體積，扣除空白試驗的數(shù)值即為每天產甲烷量。發(fā)酵結束后沼渣沼液用于秸稈組分和固液相微生物分析。

2.3 指標分析

2.3.1 常規(guī)指標

樣品用兩層紗布過濾后，固渣TS 在105 ℃下進行測定，通過厭氧瓶中TS 的變化計算干基質量降解率。秸稈和固渣中纖維素、半纖維素及木質素含量用A2000i 纖維分析儀測定，殘渣均需在65 ℃干燥箱中烘至恒量，通過發(fā)酵前后秸稈各組分變化計算纖維素、半纖維素降解率及木質素變化率，為了減少分析誤差，添加接種物后再測定秸稈各組分質量分數(shù)。沼液水解活性通過纖維素酶或木聚糖酶活性評價，參考以前的方法［14］，每毫升上清液釋放1 μg 葡萄糖或木糖的酶量規(guī)定為1 個酶活力單位（U）。在12 000 r/min 下離心10 min，所得上清液用于指標分析，每個指標重復3 次。VFAs 使用GC-2010 Plus 氣相色譜測定，pH 則通過DELTA 320 pH 計測定。

2.3.2 MiSeq 基因測序

AMPTS中沼液在800×g 下離心15 min，沉淀為固相樣品；上清液繼續(xù)在27 000×g 下離心30 min獲得液相樣品。使用Power soil?DNA 試劑盒提取初始接種物和固液相樣品DNA，引物對338F 和806R 構建擴增文庫后［15］，利用MiSeq 平臺完成測序。原始序列經(jīng)加工處理，提交到NCBI，序列號為：SRP123575 （SRA），并在Silva 16S rDNA 數(shù)據(jù)庫中比對，進行物種注釋及菌群分析。

3 結果與討論

3.1 產甲烷分析

產甲烷量日變化情況如圖1 所示。對照體系最高產甲烷量出現(xiàn)在第1 天，為122.80 mL/d，然后迅速降低。牛糞菌系添加體系有兩個產甲烷峰，分別出現(xiàn)在第4 天和第38 天，最高產甲烷量為120.35 mL/d。通過計算，甲烷產率（以VS 計） 為269.32 mL/g，相比對照體系的199.83 mL/g，提高了35%（表1）。

圖1 產甲烷量日變化情況

表1 稻秸發(fā)酵結束后甲烷產率、干基質量降解率及秸稈組分變化情況

稻秸水解階段是整個發(fā)酵的限速步驟，而牛糞中含有的水解微生物有利于稻秸復雜結構的降解［1］。添加牛糞菌系前2 天受到短暫抑制，隨后出現(xiàn)了兩次水解過程，對應兩個產氣峰，稻秸甲烷產率（以VS 計） 達到269.32 mL/g。Mussoline等［1］認為，即使通過各種物理化學預處理，稻秸甲烷產率（以VS 計） 也大多在92～280 mL/g 變動。在稻秸干法連續(xù)發(fā)酵中，張敏等［4］利用鮮牛糞構建厭氧微生物體系，在稻秸有機負荷4 kg/（m3/d）時，甲烷產率（以VS 計） 最高達到了227.8 mL/g，但試驗使用了“黃儲”破碎秸稈并添加豬糞為氮源。齊利格娃等［2］發(fā)現(xiàn)豬糞與稻秸共發(fā)酵時存在協(xié)同效應，比例為2∶1 時所有原料甲烷產率（以VS 計） 也只有213.4 mL/g；而單稻秸原料甲烷產率（以VS 計） 僅為124.7 mL/g，小于本試驗對照體系。由此可見，本研究牛糞菌系接種稻秸產甲烷具有明顯成本優(yōu)勢。

3.2 稻秸降解酶和水解酶活性

甲烷的產生來自稻秸的水解產物，因此甲烷產率的提高與底物降解率和各組分變化密切相關。如表1 所示，牛糞添加樣品的干基質量降解率為41.79%，高于對照體系的39.32%。發(fā)酵結束后，固渣中纖維素和半纖維素的降解率分別為53.97%、56.14%，和對照相比，半纖維素降解相差不大，但纖維素的水解明顯高于對照體系。木質素的苯丙烷結構降解過程需要氧氣，在厭氧條件下難以降解［9］，本研究發(fā)酵結束后木質素質量分數(shù)升高，變化率達353.77%。

纖維素酶和木聚糖酶活性變化如圖2 所示。牛糞菌系接種體系出現(xiàn)了兩個纖維素酶活性峰值，分別為26.54、32.68 U/mL，均值為18.82 U/mL；而對照中只在第8 天出現(xiàn)了峰值，之后快速下降，均值為15.10 U/mL。牛糞菌系接種體系中木聚糖酶活性均值為214.55 U/mL，明顯高于對照的137.45 U/mL。

圖2 纖維素酶和木聚糖酶活性的變化

稻秸的結構表明，纖維素成分被木質素和半 纖維素基質包裹在內部，阻止了水解酶的作用，而高活性的木聚糖酶降解半纖維素后暴露出微纖維結構，有利于纖維素的水解［16］。如在高粱厭氧發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶活性峰值比纖維素外切活性提前，兩類酶協(xié)同作用加快了高粱的水解［10］。Gu等［9］在接種牛糞稻秸發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)高活性的木聚糖酶提高了半纖維素降解率而且加快了纖維素的水解，使得沼氣產率（以VS 計） 達325.3 mL/g。本研究中木聚糖酶活性較高，半纖維素先降解，在第4 天出現(xiàn)了第1 個產甲烷峰；隨著稻秸結構的裂解，在發(fā)酵后期出現(xiàn)了纖維素酶活性峰值，纖維素降解，并在第38 天出現(xiàn)了第2 個產甲烷峰。

3.3 VFAs 濃度和pH 的變化

單個VFAs 的積累和消耗反映了水解發(fā)酵產酸與產甲烷之間的平衡。如圖3 所示，對照體系中乙酸質量濃度在第4 天達到峰值3.69 g/L，隨后逐漸降低。而牛糞菌系接種體系乙酸濃度在第4 天達到了4.35 g/L，說明開始階段水解產酸的速度大于產甲烷，導致乙酸積累。發(fā)酵過程中出現(xiàn)兩個峰值，質量濃度分別達到了4.95、3.89 g/L，36 d 后被完全利用。上述數(shù)據(jù)表明，牛糞菌系接種體系以產乙酸發(fā)酵為主，在短暫積累后被嗜乙酸型產甲烷途徑消耗，其濃度與產甲烷活性緊密相關，該現(xiàn)象與一些秸稈發(fā)酵產甲烷的代謝類型一致［14，17-19］。

圖3 發(fā)酵過程中單個VFA 濃度和pH 的變化

牛糞菌系接種體系開始階段出現(xiàn)了丙酸積累，4 d 后達1.63 g/L，高于對照體系的1.12 g/L。最高濃度出現(xiàn)在第12 天，為3.65 g/L，20 d 后濃度下降為0，而丁酸則在16 d 后濃度下降為0。對照體系中丙酸和丁酸最高濃度大于接種體系，分別達4.42、1.98 g/L。一般認為，丙酸和丁酸是水解過程產生的還原氫來不及被利用的產物，只有通過互營氧化作用才能克服熱力學障礙，而氧化菌生長緩慢，因此易導致體系的酸化［11］。本研究牛糞菌系接種開始階段丙酸積累表明了嗜氫型產甲烷受到抑制，這也解釋了體系直到第4 天才出現(xiàn)第1次產甲烷峰。同時這也是pH 在第20 天時降至6.73 的原因，但共接種物中含有的互營氧化菌群能利用丙酸和丁酸，使得pH 在整個發(fā)酵過程中均值維持在7.48，處于適宜的產甲烷范圍［6］。

3.4 微生物結構特征

發(fā)酵結束后細菌結構在門水平上相對豐度的變化如圖4 所示，其中厚壁菌門（Firmicutes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes） 和熱袍菌門（Thermotogae）在發(fā)酵后固液相中都占主導地位。擬桿菌門（Bacteroidetes） 和WWE1 在液相中含量提高明顯，而綠彎菌門（Chloroflexi）、變形菌門（Proteobacteria） 則在固相上的相對豐度增加。Sun 等［20］研究認為無論接種物來自于反應器還是活性污泥，纖維素或稻秸發(fā)酵體系中，F(xiàn)irmicutes 都占主導地位。其中梭菌目（Clostridiales） 中的種屬，如梭菌屬（Clostridium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、毛螺菌屬（Lachnospira）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）等，能在秸稈降解中發(fā)揮重要作用［21］。Synergistetes 能和嗜乙酸型甲烷菌形成互營菌群［22］，牛糞菌系接種體系中該門菌屬相對豐度的提高表明了互營氧化作用的強化。Thermotogae 能利用碳水化合物產VFAs［23］，有利于發(fā)酵活性的提高。Spirochaetes中的螺旋體目（Spirochaetales） 則與水解木質纖維素、發(fā)酵產酸活性的增強有關［19］。液相中Bacteroidetes 菌屬，如擬桿菌屬（Bacteroides）、普氏菌屬（Prevotella） 的出現(xiàn)既參與秸稈水解又能發(fā)酵產酸［24-25］，從而提高了發(fā)酵代謝活性。而WWE1首先在處理活性污泥的厭氧反應器中被發(fā)現(xiàn)，能利用發(fā)酵產物產酸［26］，在對照體系中相對豐度的提高與VFAs 積累緊密相關。固相中相對豐度提高的菌群中，Chloroflexi 主要是碳水化合物的降解菌［27］。Proteobacteria 如互營桿菌屬（Syntrophobacter）、消化腸狀菌屬（Pelotomaculum） 等，常出現(xiàn)在活性污泥降解體系中，在互營氧化過程中發(fā)揮作用［11］。固液相菌群結構的分析有利于揭示厭氧發(fā)酵體系的強化機制［6］。

圖4 發(fā)酵結束后細菌結構在門水平上相對豐度的變化

3.5 功能種屬分析

3.5.1 固相功能菌群

固相中來源于接種污泥及牛糞菌系特定功能微生物的變化如表2 所示，Clostridium 是體系中的主要水解菌，對照體系豐度的升高易導致VFAs 的積累［5］。來源于牛糞菌系的高效纖維素水解菌瘤胃球菌（Ruminococcus）、纖維桿菌（Fibrobacter）在體系中的相對豐度高于對照，這也解釋了牛糞菌系接種后稻秸纖維素水解酶酶活及降解率顯著提高的現(xiàn)象。Chapleur 等［28］在纖維素的降解中，添加瘤胃液和市政廢棄物污泥共發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)瘤胃水解菌從體系中消失，研究者歸因于無法與污泥中功能菌競爭，這與本研究所得結論不一致。Lutispora 及沉積桿菌屬（Sedimentibacter） 等屬于多糖降解產乙酸菌［19，29］，在牛糞添加體系中相對豐度的提高表明產乙酸代謝途徑得到強化，提高了產甲烷效率。如Deng 等［14］在研究稻秸和瘤胃內含物共發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)固相上這兩類菌屬的含量提高，與產甲烷活性增強密切相關。

一些來源于污泥的部分菌屬在牛糞菌系接種體系中含量降低或消失。如在沼氣反應器中能降解各種多糖物質的Bacteroides［24］，毛螺菌科（Lachnospiraceae） 中可溶性多糖降解菌Lachnospira［30］，該類菌群的變化被認為與稻秸降解中不同水解微生物存在競爭有關［29］。

如表2 所示，牛糞菌系接種體系中甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina） 是主要類型，這和牛糞菌系接種中乙酸的積累有關。來源于牛糞的甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter） 在發(fā)酵結束后相對豐度升高，達到了0.009 5%；而對照體系甲烷菌類型中鬃毛甲烷菌（Methanosaeta） 的相對豐度最高。在豬糞和稻草共發(fā)酵配比試驗中，發(fā)現(xiàn)豬糞含有的易降解成分易導致VFAs 積累，降低了Methanobrevibacter 的相對豐度［2］，與本研究甲烷菌的變化不一致。在青貯牧草降解試驗中，Methanosarcina 被發(fā)現(xiàn)位于固渣表面，研究者認為由于纖維素水解產生的乙酸在固相上來不及擴散，乙酸濃度的升高增強了Methanosarcina 的附著生長［18］。在稻秸厭氧發(fā)酵試驗中，通過殘渣微生物形態(tài)和功能菌群分析發(fā)現(xiàn)水解菌和Methanosarcina共存在固相上時，水解效率大大提高［14］。李奧等［8］在豬糞與稻秸共發(fā)酵試驗中，也發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵結束后Methanosarcina 相對豐度顯著提高。這也從甲烷菌類型上解釋了牛糞菌系接種體系中嗜乙酸產甲烷代謝強化的現(xiàn)象。在豬糞與玉米秸稈共發(fā)酵試驗中，Methanosarcina 占優(yōu)勢地位，但隨著有機負荷升高，嗜氫型Methanobrevibacter 相對豐度有所提高，并獲得高的甲烷產率［6］，與本研究甲烷菌結構特點一致。研究表明，牛糞中存在的水解菌Ruminococcus、Fibrobacter 和 嗜 氫 型Methanobrevibacter 存在種間氫傳遞，當體系產生的氫被Methanobrevibacter 利用后，能夠實現(xiàn)氧化型NAD+載體的重生，水解和產甲烷活性都得到提高［21］。如在柳枝稷發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)Methanobrevibacter對纖維素結構的水解起了重要作用［31］。而另一方面，嗜氫型甲烷菌活性如果受到抑制，會使水解微生物含量下降。如添加抑制產甲烷活性的溴乙基磺酸鈉（BES），導致高效水解菌Ruminococcus 從小麥秸稈發(fā)酵體系中消失［32］。本研究中接種牛糞菌系提高了Methanobrevibacter 在體系中的相對豐度，有利于加快種間氫傳遞，使稻秸的纖維素水解和產甲烷活性都得到了提高。

表2 固相上特定功能細菌和甲烷菌屬相對豐度的變化 %

3.5.2 液相功能菌群

液相中丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、密螺旋體菌屬（Treponema）、Prevotella 等屬于產酸微生物［19，21］，和纖維素水解菌存在協(xié)同作用。如半纖維素降解菌Butyrivibrio、Treponema 可以和Ruminococcus、Fibrobacter 共同結合在稻秸和苜蓿上，首先裂解結構中的木聚糖成分，而后實現(xiàn)對纖維素結構的降解［33］。Prevotella 種屬能參與半纖維素成分的降解，發(fā)酵后產生不同類型的VFAs［25］。如表3 所示。降解產酸菌的出現(xiàn)也解釋了體系中木聚糖酶活性的提高。發(fā)酵結束后，對照體系中該類產酸菌屬相對豐度較高，降解產生的丁酸、乳酸及琥珀酸積累，易導致體系酸化，反而抑制了產甲烷活性［17］。

來源于接種物的氧化菌能夠和伴生菌形成互營氧化菌群，有利于降低VFAs 的濃度［11］。如表3所示，本研究中互營桿菌（Syntrophobacter） 和丙酸氧化菌（Pelotomaculum） 等主要存在于對照體系中；而氨基桿菌屬（Aminobacterium）［22］及丁酸型互營單胞菌屬（Syntrophomonas） 等在接種體系相對豐度較高，能通過互營氧化作用降低丙酸和丁酸濃度。但在豬糞添加小麥秸稈發(fā)酵的研究中，發(fā)現(xiàn)液相中存在Pelotomaculum，與Methanosaeta 形成互營菌群，增強了丙酸氧化效率［12］，與本研究接種體系液相中互營菌類型不一致。液相中菌屬的變化也進一步表明了體系中嗜乙酸產甲烷途徑占主導優(yōu)勢，降低了丙酸和丁酸的積累。

表3 液相上功能菌相對豐度的變化 %

4 結論

1） 牛糞菌系接種稻秸發(fā)酵試驗中，分別在第4 天和第38 天出現(xiàn)了產甲烷峰，稻秸甲烷產率（以VS計） 達269.32 mL/g，比對照體系提高了35%。稻秸的干基質量降解率達41.79%，纖維素和半纖維素的降解率分別為53.97%、56.14%。纖維素酶和木聚糖酶活性均值分別為18.82、214.55 U/mL。

2） 發(fā)酵結束后，細菌菌群結構的變化明顯，固相上水解功能菌Ruminococcus、Fibrobacter 的相對豐度高于對照體系，產乙酸菌Lutispora、Sedimentibacter 相對豐度提高。Methanosarcina 是主要甲烷菌類型，Methanobrevibacter 相對豐度升高。在液相中，Treponema、Prevotella 等產酸微生物主要存在于對照體系中。Aminobacterium 和Syntrophomonas 等互營氧化菌在接種體系中相對豐度較高，而Syntrophobacter 和Pelotomaculum 是對照體系的主要類型。