基于網絡藥理學方法探究中藥肉桂治療糖尿病的作用機制

王珺，蘇本正，蔣海強，孫雨，楊鈺涵，崔寧，于宗淵*

(1.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014)

糖尿病是一種臨床常見的、多發的、因體內胰島素分泌相對或絕對不足引起的代謝紊亂性疾病[1]。隨著人們生活水平的提高，飲食結構和習慣不斷改變，糖尿病發病率也隨之持續增長[2]。糖尿病病因和發病機制復雜，目前臨床上暫無特效、穩定的治療與預防方法[3]，通常通過藥物、飲食療法、運動療法等綜合治療手段控制患者的血糖水平。雙胍類降糖藥是糖尿病治療中常用的口服降糖藥，其降糖效果較好，但長期使用仍會出現血糖過低、過敏等不良反應[4-5]。近年來，中醫藥在治療糖尿病方面取得了可喜的療效，中草藥的治療效果溫和而安全，已成為治療糖尿病的普遍選擇。

肉桂為樟科樟屬植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.的干燥樹皮[6]，是傳統中藥，具有補火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經脈的功效[7]。現代藥理學研究表明，肉桂具有抗癌、抗炎鎮痛、抗菌、降血糖、心血管保護、細胞保護、神經保護、免疫調節等多種生物活性[8]。研究發現，肉桂在治療糖尿病方面有很好的療效，可降低血糖、血脂[9-10]，具有明顯改善胰島素抵抗的作用，然而，對于肉桂在糖尿病治療中的藥效成分和作用機制仍缺乏全面了解。近年來，生物信息學技術迅猛發展，網絡藥理學方法逐漸成為系統揭示中藥分子機制的重要手段。網絡藥理學將藥物和靶點抽象成網絡模型，從網絡層面上系統、全面地揭示藥物作用機制[11-12]。因此，本研究旨在借助網絡藥理學方法和分子對接技術，探索肉桂的藥效成分、作用靶點和信號通路之間的網絡關系，闡明其治療糖尿病的生物學機制，為肉桂治療糖尿病的臨床用藥提供科學依據及新的思路。

1 材料與方法

1.1 肉桂有效成分與靶點篩選

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine system pharmacology datebase and analysis platform，TCMSP)數據庫(http://tcmspw.com/)中，設置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%，檢索并篩選肉桂的化學成分信息[13]。活性成分的靶點蛋白信息從TCMSP數據庫中獲取，再利用UniProt數據庫(http://tcmspw.com/index.php)校正靶點蛋白為規范的基因名稱，刪除無靶點成分，整理得肉桂的有效成分及對應靶點數據信息。

1.2 疾病靶點篩選

在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中以“糖尿病(diabetes)”為關鍵詞，檢索已報道的與糖尿病相關靶點的信息。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建

將1.1項下的成分靶點與1.2項下的疾病靶點進行映射，以獲得肉桂治療糖尿病的潛在靶點。為了更好地分析靶點蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)，借助STRING Version 11.0 數據庫(https://string-db.org/)構建潛在靶點的PPI網絡，限定物種為人(Homo sapiens)，去除孤立靶點。再將PPI網絡圖導入Cytoscape 3.6.1軟件進行拓撲屬性分析，分析網絡圖中的關鍵節點及度值，得到核心靶點。

1.4 GO和KEGG富集分析

為說明肉桂治療糖尿病有效成分的核心作用靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究采用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)Version 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析，利用STRING數據庫進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，通過基因的富集分析預測肉桂治療糖尿病的可能機制。

1.5 成分與靶點對接

采用AutoDock vina軟件對核心靶點中度值(degree)排名前五的靶點蛋白與肉桂中的關鍵成分進行分子對接驗證，并用傳統治療藥物二甲雙胍作對照分析。通過ZINC數據庫(https://zinc.docking.org/)獲取中藥小分子配體的3D結構，全部保存為mol2格式。從RCSB PDB結構數據庫(www.rcsb.org/)中獲得靶點蛋白和二甲雙胍的三維結構，用PyMOL 1.7軟件去除受體蛋白中的溶劑。利用AutoDock Tools軟件為受體和配體加氫、計算電荷并賦予原子類型，再運用Autodockvina軟件在Windows 10環境下批量對接，得到結合能，用PyMOL 1.7軟件對對接結果進行可視化分析。

2 結果

2.1 肉桂主要活性成分及靶點篩選

根據TCMSP數據庫及文獻查找收集篩選后，共獲得肉桂的有效成分32個，對應靶點244個，具體信息見表1。在GeneCards數據庫中檢索得到糖尿病相關靶點1592個。二者映射后得到交集基因131個。將篩選出的32個有效成分及131個交集基因導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建成分-靶點網絡圖(圖1)。該網絡包含163個節點和240條邊，六邊形代表肉桂成分，菱形代表靶點蛋白。分析各化學成分的度值，得到肉桂中度值排名前十的關鍵成分，包括槲皮素、油酸、丁香酚、萜基烯、異丁香酚甲醚、肉桂醛、鄰苯二甲酸二異丁酯、茴香烯、原花青素B1和4-羥基-4-甲基-2-戊酮。其中，槲皮素的度值最大，說明其在有效成分和靶點中起到關鍵作用。

表1 肉桂活性成分篩選結果

圖1 肉桂成分-靶點網絡

2.2 靶點PPI網絡分析

圖2表示肉桂治療糖尿病的潛在靶點的PPI網絡。該網絡中共包含130個節點和2437條邊。節點越大，則靶點蛋白的度值越大[14]。節點顏色由藍色變為橙色代表靶點蛋白的度值由大變小。節點根據網絡拓撲學參數，以度值≥69、介數(betweenness)≥67.956為篩選條件，共得到20個核心靶點蛋白CCL2、INS、PPARG、IL6、JUN、FOS、TNF、IL1B、CASP3、VEGFA、EGFR、EGF、CAT、AKT1、CXCL8、NOS3、PTGS2、TP53、MMP9、MAPK1(圖3和表2)，提示這些蛋白在肉桂抗糖尿病機制中發揮關鍵作用。

圖2 潛在靶點PPI網絡

圖3 核心靶點網絡

表2 核心靶點信息

2.3 GO和KEGG富集分析結果

利用DAVAID 6.8平臺對肉桂治療糖尿病的核心靶點進行GO富集分析，根據P值得到GO條目45條(P<0.05)，其中生物過程32條，主要涉及RNA聚合酶II啟動子對轉錄的正調控、凋亡過程的負調控、炎癥反應、內皮細胞增殖的正調控、細胞生長的正調控等方面；細胞組成相關條目4條，主要涉及胞外間隙和轉錄因子復合體等方面；分子功能相關條目9條，主要涉及一氧化氮合酶調節因子活性、染色質結合、轉錄調節區DNA結合等方面。選取生物過程中P值較高的前20個條目以及細胞組成和分子功能條目進行可視化(圖4)。

圖4 肉桂治療糖尿病的GO富集分析

利用STRING數據庫對20個核心靶點進行通路富集分析(P<0.05)。根據KEGG通路富集分析結果(圖5)，預測肉桂主要通過糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、癌癥通路和MAPK信號通路等途徑治療糖尿病(表3，詳細信息見OSID)。

表3 肉桂治療糖尿病的KEGG信號通路

圖5 肉桂治療糖尿病的KEGG信號通路分析

2.4 分子對接結果

將PPI網絡中度值排名前5的靶點蛋白(INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA)分別與二甲雙胍和10個關鍵成分進行分子對接驗證(表4)。結果顯示，10個關鍵成分與5個靶點蛋白的結合能均良好，并且肉桂中部分活性成分與靶點對接的結合能明顯低于陽性藥。其中，原花青素B1與INS、原花青素B1與IL6、槲皮素與TNF、槲皮素與IL6、原花青素B1與VEGFA的結合能較小，分子結合構象穩定(圖6)。結合上述結果，肉桂成分與核心靶點均具有良好的結合活性，表明肉桂可能通過作用于關鍵靶點而對糖尿病發揮治療作用。

表4 成分與靶點的對接結果

圖6 蛋白-配體對接模擬

3 討論

中醫學稱糖尿病為“消渴”，其病機主要為陰虛燥熱、氣陰兩虛、陰損及陽、陰陽兩虛[15]。中醫臨床上常用肉桂治療糖尿病的陰陽兩虛階段，尤其是陽虛階段[10]。有研究發現，肉桂能調節2型糖尿病患者的空腹血糖水平[16]，還能增加GLP-1(腸升糖素樣肽1)的分泌，抑制葡萄糖苷酶的活性，促進GLUT-4(葡萄糖轉運蛋白4)的表達[17]。此外，肉桂中的多酚類物質還可以增加胰島素含量，改善胰島素敏感性[18]。由此可見，肉桂在治療糖尿病方面具有一定功效。

本研究利用網絡藥理學數據庫對肉桂的主要有效成分進行了研究，以OB≥30%作為篩選標準，共篩選出32個活性化合物，作用于131個糖尿病靶點。其中，槲皮素、油酸、丁香酚、萜基烯、異丁香酚甲醚、肉桂醛、鄰苯二甲酸二異丁酯、茴香烯、原花青素B1和4-羥基-4-甲基-2-戊酮等10種成分的度值較高，提示這些成分可能是肉桂治療糖尿病的重要成分，值得進一步研究。槲皮素的度值遠高于其他成分，預測是肉桂中發揮藥效的主要物質。槲皮素是典型的黃酮類化合物，具有多種生理活性，包括抗癌、抗氧化、抗纖維化、抗炎、抗菌、抗衰老、抗抑郁癥、抗白血病、抗糖尿病等多種生物活性[19]。現有研究發現，槲皮素能夠減輕高糖誘導的大鼠氧化應激指標，降低血糖，減輕大鼠外周胰島素抵抗，治療效果與二甲雙胍一致[20]。油酸可以直接刺激胰臟分泌胰島素，且會加強葡萄糖刺激胰島素分泌的作用。肉桂醛可以增加脂肪和骨骼肌組織對葡萄糖的攝取，促進肝臟糖原合成，改善胰島素敏感性，維持糖尿病動物的血糖和血脂穩態[21]。原花青素能促進肝糖原儲存以及胰島素抵抗細胞內的葡萄糖消耗[22]。在本研究中，槲皮素、油酸、肉桂醛、原花青素等成分能調節大多數糖尿病的靶點，說明這些成分可能是治療糖尿病的代表性化合物，此外，通過網絡分析發現它們還共同作用于前列腺素G/H合酶2(PTGS2)靶點，胰腺β細胞中PTGS2的表達與胰島素的表達密切相關，抑制PTGS2可劑量依賴性地促進胰島素的分泌，調節血糖[23]。以上研究表明，肉桂治療糖尿病具有多成分協同作用的特點。

肉桂與糖尿病的交集靶點共131個，說明肉桂是通過多靶點協同起到治療糖尿病的作用。INS(胰島素)是血糖濃度的主要調節因子，可以阻斷糖原分解和糖異生，刺激脂肪生成、糖原和蛋白質合成，增加肌肉和脂肪對葡萄糖的攝取，從而起到降低血糖濃度的作用[24]。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是胰島素信號通路下游的重要靶點，具有抑制細胞凋亡和調節代謝的作用，能夠阻止胰島素受體去磷酸化，調節葡萄糖轉運環節[25-27]。IL-6和TNF是具有多種功能的細胞因子，可直接損傷胰島β細胞，誘發胰島素抵抗。TNF可通過抑制胰島素信號的傳遞, 進而導致胰島素抵抗[28]。在PPI網絡中, INS、AKT1、IL6、TNF和VEGFA的度值最高，說明它們在治療糖尿病過程中起到重要作用。這些結果與網絡藥理學及分子對接結果共同表明，INS、AKT1、IL6、TNF和VEGFA等靶點可能是肉桂抗糖尿病活性的關鍵靶點，也提示使用網絡藥理學預測靶點具有一定的科學性與準確性。

此外，本文還對肉桂治療糖尿病的核心靶點進行了KEGG通路富集分析，結果顯示，這些靶點作用于糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、癌癥通路和MAPK信號通路等，這些通路之間相互影響，介導疾病的炎癥反應、信號轉導等過程，為肉桂治療糖尿病的主要通路。MAPK可通過磷酸化靶蛋白來調控信號通路，促進能量代謝[29]；還可通過上調GLUT-4的表達，促進葡萄糖的吸收和利用，增強胰島素受體的敏感性，從而改善胰島素抵抗[30]。另有研究發現，肉桂醛能夠促進分泌血管內皮細胞生長因子(VEGFA)，這與MAPK信號通路活性上調相關[31]。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學方法和分子對接技術對中藥肉桂所含的藥效成分、靶點及作用途徑進行研究，發現肉桂能夠通過多成分、多靶點、多種生物途徑及多條通路達到治療糖尿病的目的，為肉桂臨床治療糖尿病提供了理論基礎。