基質成纖維細胞對卵巢癌細胞增殖能力的影響及相關分子機制▲

張 亞 楊英捷

(貴州省腫瘤醫院婦瘤外科，貴陽市 550000，電子郵箱：howardfine@163.com)

卵巢癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，浸潤和轉移是造成卵巢癌高死亡率的主要原因，其中卵巢癌的轉移主要通過直接擴散的方式轉移至腹腔，不依賴于血管和淋巴管。最新研究表明，腫瘤的發生和發展與腫瘤-宿主微環境的平衡狀態密切相關，上皮惡變和間質轉化的交互作用共同決定了腫瘤的進展[1]。腫瘤受到由癌細胞、基質成纖維細胞、炎癥細胞、內皮細胞以及細胞外基質組成的獨特微環境的影響[2]，其中基質成纖維細胞是腹腔網膜中的第二大類型細胞。既往研究顯示，基質成纖維細胞分泌多種細胞因子作用于癌細胞，其自身在各種類型的腫瘤發生發展過程中均發揮重要作用[3]。轉移癌細胞擴散后在遠處的生長，稱為“轉移定植”，這一過程對手術去瘤后殘留的微小腫瘤的存活至關重要[4]。然而，在網膜組織微環境中，基質成纖維細胞如何促進卵巢癌轉移定植的分子機制尚不清楚。本研究針對基質成纖維細胞對卵巢癌SKOV-3細胞增殖的影響進行了初步觀察，以便全面地了解基質成纖維細胞在卵巢癌轉移定植中的作用，為進一步研究基質成纖維細胞調控卵巢癌的進展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料和細胞 收集無菌條件下切取的卵巢轉移癌組織24例，所有標本均新鮮、完整，包含上皮組織及其鄰近結締組織，均經臨床和病理學證實。人卵巢癌細胞系SKOV-3、基質成纖維細胞WI38購自中國科學院細胞中心。杜氏改良伊戈爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)、RNA提取試劑TRIzol為美國Invitrogen公司產品(批號：C10268951、15596-026)；AMV反轉錄酶、PCR Taq酶、SYBR Premix Ex Taq購于日本TaKaRa公司(批號：9068-38-6、47001-3D、A3701)，表皮細胞生長因子(epidermal growth factor,EGF)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、轉化生長因子α(transforming growth factor α,TGF-α)酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司(批號：E-EL-H0059C、E-EL-H0102C、E-EL-H1586C)，四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑、二喹啉甲酸蛋白測定試劑盒、RIPA裂解液、電化學發光液購于碧云天生物技術研究所(批號：C0009、P0012S、P0013B、P0018S)，小鼠抗人TGF-α抗體、兔抗人表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體、生物素標記的羊抗小鼠均購于英國Abcam 公司(批號：ab32536、ab78901、ab54378、ab87612)。

1.2 條件培養基的收集及細胞培養 將卵巢癌細胞SKOV-3和基質成纖維細胞WI38分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，放在37℃、5%二氧化碳、相對濕度為90%的培養箱中進行培養，待細胞貼壁生長；收集卵巢癌細胞SKOV-3和基質成纖維細胞WI38培養24 h后的條件培養基，-80℃保存備用。取卵巢癌細胞SKOV-3以3×103個/孔的密度接種于96孔培養板中，待細胞貼壁之后分別更換上述條件培養基，置于37℃、5%二氧化碳、相對濕度為90%的培養箱中培養。本實驗中，將卵巢癌細胞系條件培養基及經其處理的細胞作為對照組，基質成纖維細胞條件培養基及經其處理的細胞作為實驗組。

1.3 條件培養基對卵巢癌細胞SKOV-3增殖作用的影響 分別于條件培養基處理24 h、48 h、72 h后，收集卵巢癌細胞SKOV-3，采用MTT法檢測培養板中SKOV-3細胞的增殖情況，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。通過Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo公司)于490 nm波長處檢測樣本吸光度(A值)。實驗獨立重復3次。

1.4 實時熒光定量PCR檢測條件培養基處理后卵巢癌細胞SKOV-3中EGFR mRNA表達水平 使用TRIzol裂解收集條件培養基處理24 h后的卵巢癌SKOV-3細胞，采用酚-氯仿抽提法提取細胞總RNA。利用反轉錄試劑反轉錄為cDNA,反轉錄體系：RNA 2 μg，隨機引物1 μL，反應緩沖液1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，dNTP 1 μL，逆轉錄酶1 μL。反轉錄條件為：65℃ 5 min，42℃ 1 h，70℃ 5 min。通過CFX96型定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)進行實時熒光定量PCR實驗，檢測EGFR mRNA相對表達水平。EGFR基因引物序列：上游5′-AAACCGGACTGAAGGAGCTG-3′，下游5′-CCCATTGGGACAGCTTGGAT-3′；以β-肌動蛋白為內參，引物序列：上游5′-AAGAGAGGCATCCTCACCCT-3′，下游5′-GGAAGGAAGGCTGGAAG-3′。引物均由上海生工生物有限公司合成。PCR反應體系(共20 μL)：2×SYBR Green Mix 10 μL，ROX 0.4 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，雙蒸水7.0 μL，cDNA 1.0 μL。反應條件為：94℃預變性4 min 45 s，然后94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環30次，最后72℃充分延伸5 min。采用2-ΔΔCt法計算EGFR mRNA相對表達水平。實驗獨立重復3次。

1.5 免疫印跡技術檢測條件培養基處理后卵巢癌細胞SKOV-3中EGFR蛋白表達水平 收集條件培養基處理24 h后的卵巢癌SKOV-3細胞，使用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，按照二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒說明書檢測總蛋白濃度。取80 μg蛋白經10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離后轉至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜 15 min(洗滌3次，5 min/次)。加入兔抗EGFR抗體(1 ∶500)，4℃過夜，TBST洗膜(洗滌3次，5 min/次)后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(1 ∶5 000)二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜(洗滌3次，5 min/次)后滴加電化學發光液顯色，凝膠成像儀(美國 Bio-Rad 公司)曝光，使用Image J軟件進行蛋白表達分析。實驗獨立重復3次。

1.6 條件培養基中細胞因子EGF、IL-6及TGF-α水平的檢測 分別收集卵巢癌細胞SKOV-3和基質成纖維細胞WI38培養24 h后的條件培養基，4 000 r/min離心5 min除去細胞碎片，收獲上清用于檢測。采用ELISA法檢測EGF、IL-6、TGF-α水平，按照試劑盒說明書進行操作。實驗獨立重復3次。

1.7 免疫組織化學法檢測卵巢癌組織TGF-α和EGFR的表達 每例病例選取3張相鄰腫瘤組織切片，分別進行TGF-α、EGFR抗原免疫組織化學染色和蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。免疫組織化學染色：經脫蠟、水化、微波抗原修復后，3%過氧化氫緩沖液室溫孵育15 min，阻斷內源性過氧化物酶活性；磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次(10 min/次)，山羊血清室溫封閉30 min封閉非特異性背景染色；分別滴加小鼠抗人TGF-α抗體(1 ∶100)和兔抗人EGFR抗體(1 ∶100)，4℃孵育過夜；磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次(10 min/次)；分別滴加生物素標記的羊抗小鼠IgG或生物素標記的羊抗兔IgG，室溫孵育30 min；磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次(10 min/次)，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30 min；磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次(10 min/次)，二氨基聯苯胺液顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。對照組一抗以磷酸緩沖鹽溶液替代。根據著色情況及著色百分率，參考相關文獻[5]對免疫組化染色結果進行分析。陽性細胞為棕褐色，隨機選擇5個視野進行計數，每個視野計數200個細胞，著色百分率<5%為陰性，5%～25%為弱陽性，26%～50%為中度陽性，>50%為強陽性。實驗獨立重復3次。

1.8 統計學分析 用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩樣本獨立t或t′檢驗；相關性分析使用Spearman秩相關。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 條件培養基對卵巢癌細胞株SKOV-3增殖作用的影響 在干預后的3個時間點，實驗組SKOV-3細胞的活力均高于對照組(均P<0.05)。見表1及圖1。

圖1 光鏡下觀察各時間點兩組細胞的增殖情況

2.2 條件培養基處理后卵巢癌細胞SKOV-3中EGFR mRNA及蛋白表達水平 條件培養基處理24 h后，實驗組SKOV-3細胞中EGFR mRNA和蛋白相對表達水平均高于對照組(P<0.05)，其中實驗組SKOV-3細胞EGFR mRNA表達水平為對照組的3.55倍。見表2和圖2。

表2 兩組卵巢癌SKOV-3細胞EGFR mRNA及蛋白相對表達水平比較(x±s)

圖2 兩組卵巢癌細胞SKOV-3中EGFR蛋白的表達情況

2.3 條件培養基中細胞因子EGF、IL-6及TGF-α水平的檢測 實驗組條件培養基中TGF-α的水平高于對照組(P<0.05)，但兩組的EGF、IL-6水平差異無統計學意義(均P>0.05)。見表3。

表3 兩組培養基細胞因子EGF、IL-6及TGF-α水平比較(x±s,ng/mL)

2.4 卵巢轉移癌組織中TGF-α和EGFR的表達情況及其相關性 TGF-α和EGFR在卵巢轉移癌組織中均呈高表達(見圖3)，兩者的陽性表達情況呈正相關性(rs=0.812,P<0.001)。見表4及圖3。

表4 卵巢轉移癌組織中TGF-α和EGFR表達情況[n(%)]

圖3 卵巢轉移癌組織免疫組織學及HE染色結果

3 討 論

間質細胞與細胞外基質構成的腫瘤微環境在腫瘤形成發展過程中扮演重要的角色[6]。腫瘤細胞的間質微環境顯著特征包括：基質成分改變，炎性細胞增多，微血管密度增加，出現活化的成纖維細胞[7]。間質中活化的成纖維細胞通過分泌多種可溶性因子，上調金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的表達，并降解和重構細胞外基質，進而促進腫瘤進展[8]。事實上，已有體內外實驗表明，基質成纖維細胞可以顯著刺激前列腺癌上皮細胞生長[9]。Lebret等[10]發現，成纖維細胞和成纖維細胞條件培養基的一個突出作用就是通過旁分泌機制刺激乳腺癌細胞的增殖。然而有關基質成纖維細胞在卵巢癌轉移定植中的作用仍然不甚清楚。因此，本研究探討了基質成纖維細胞對卵巢癌細胞增殖能力的影響，并初步分析旁分泌TGF-α/EGFR信號軸在這一過程中的作用。

EGFR是一種重要的細胞生長調節因子，對穩定內環境具有重要作用，其介導的信號可調控細胞增殖，抑制細胞凋亡，誘發腫瘤血管生成，增強腫瘤細胞遷移和侵襲能力[11]。在胰腺癌、前列腺癌、腎細胞癌等多種惡性腫瘤中均存在EGFR表達異常的現象[12]。Zhang等[13]的研究表明，在婦科腫瘤如宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌及乳腺癌中均可見EGFR的高表達，而卵巢癌中EGFR的陽性率高達78.7%[14]。高表達或異常表達的EGFR引起下游信號通路的激活，將增殖分裂信號轉導至細胞內，從而改變細胞生長特性并促進細胞的惡性轉化；同時，EGFR還與卵巢癌分期密切相關，惡性程度越高則EGFR表達水平越高[15]，進一步證實EGFR可以作為判斷卵巢腫瘤惡性程度的一個參考指標。另外，有臨床研究表明，EGFR靶向藥物吉非替尼可以顯著抑制異種移植模型中卵巢癌的腹腔內播散或腹膜轉移，表明EGFR對卵巢癌細胞的腹膜轉移定植至關重要[16]。本研究中，經基質成纖維細胞條件培養基處理的卵巢癌SKOV-3細胞的活力升高(P<0.05)，說明基質成纖維細胞可能通過旁分泌方式促進卵巢癌細胞的增殖；且經基質成纖維細胞條件培養基處理的卵巢癌SKOV-3細胞EGFR mRNA及蛋白相對表達水平增高(P<0.05)，說明基質成纖維細胞對卵巢癌細胞的增殖促進作用可能與EGFR的激活密切相關。

EGFR的活化依賴于配體的結合，TGF-α是EGFR的配體之一。通過自分泌TGF-α并激活EGFR下游信號是卵巢癌調節腫瘤生長和侵襲的主要機制之一[17]。然而，既往研究顯示，卵巢癌細胞中TGF-α呈低水平表達[18]，說明癌細胞自分泌TGF-α不是促進卵巢癌細胞轉移定植的關鍵因素。既然基質成纖維細胞的條件培養基能夠促進卵巢癌細胞增殖并活化EGFR，那么卵巢癌細胞極有可能接受基質成纖維細胞來源的TGF-α的調控，促進自身存活和轉移定植。本研究結果顯示，實驗組條件培養基中TGF-α的水平升高(P<0.05)，提示基質成纖維細胞可能通過分泌TGF-α促進EGFR活化；我們進一步在卵巢轉移癌組織中檢測到TGF-α和EGFR的陽性表達情況呈正相關性(P<0.05)，這進一步說明旁分泌TGF-α/EGFR信號軸在基質成纖維細胞促進卵巢癌細胞增殖和轉移定植中的關鍵作用。

綜上所述，基質成纖維細胞通過旁分泌方式促進卵巢癌細胞增殖，從而參與卵巢癌的轉移定植，而旁分泌TGF-α/EGFR信號軸在其中發揮重要作用，這一結果或可為以后深入研究卵巢癌轉移定植機制提供參考。