尿源性干細胞外泌體對移動性牙根吸收修復的影響及其作用機制▲

顧 磊 戴紅衛 周雯雯 周建萍

(1 重慶市消防總隊醫院口腔科，重慶市 401122，電子郵箱：guoaili1982@126.com；重慶醫科大學附屬口腔醫院2 正畸科，3 修復科，重慶市 404100)

2008年美國維克森林大學再生醫學研究中心首次從人尿液中分離純化得到了一種具有無限自我更新能力和體外繁殖能力的細胞，其具備祖細胞特征，故將其命名為“人尿源祖細胞”。后續相關實驗證明，該類細胞具有與間充質干細胞類似的多向分化潛能，因此將其更名為“人尿源性干細胞”[1]。眾所周知，干細胞具有極強的自我更新和多向分化能力，一直以來在藥物篩選和疾病治療中研究最為廣泛，臨床上利用自體干細胞移植治療急性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤等疾病，治愈率高，且安全可靠[2]。雖然大部分干細胞來源較為廣泛，但對其獲取途徑要求極高，制備難度較大，而尿源干細胞制備方便，安全可靠，來源廣泛且不存在倫理學爭議，因此具有極好的臨床治療前景[3]。近年來，隨著對尿源干細胞研究的不斷深入，發現其在皮膚系統、神經系統、泌尿系統、生殖系統以及運動系統疾病中均具有較好的治療效果[4]。

正畸力作用于牙齒時，可利用牙周膜進行傳遞力量，傳遞至牙槽骨后可導致牙槽骨改建或牙周膜更新，最終造成牙齒移動。牙齒在移動過程中會出現不同程度的牙根吸收，發生率為3%～100%，而牙根吸收長度超過3 mm的發生率可達30%[5-7]。牙根吸收作為正畸治療的常見并發癥之一，其致病原因以及發生機制目前尚未十分清楚。本研究利用大鼠移動性牙根吸收修復模型，探討尿源性干細胞外泌體對移動性牙根吸收修復的影響及其作用機制。

1 實驗動物與方法

1.1 實驗動物 10只周齡為10周的健康SD大鼠，均為雄性，體重230～260 g，購自北京維通利華公司(動物合格證號：SCXK20060009)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組：將大鼠飼養于實驗動物中心，濕度設置為(55±5)%，溫度設置為(25±5)℃，并設置晝夜節律為12 h，標準飲食喂養、自由飲水。適應性喂養1周后，將其按照隨機數表法分為對照組和實驗組，每組5只大鼠。

1.2.2 建立正畸移動性牙根吸收模型：參考J?ger等[8]的方法建立模型。首先以3 mL/kg的劑量給予大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉。麻醉后將大鼠仰臥固定于鼠板上，采用低速金剛砂車針在上頜第一磨牙的近中牙頸部和中切牙的牙頸部磨出深度為0.2 mm的淺凹。正畸矯治力施加在左上頜，在大鼠上頜左側第一磨牙與上切牙之間安置直徑為8 mm的彈簧，彈簧兩端用細結扎絲進行固定，利用測力器施加100 g的矯治力[9]，使磨牙向近中方向移動，并對結扎絲末端進行調整，避免牙齦受到不良刺激。在施加矯治力的過程中注意避免損傷周圍軟組織，手術過程須精細謹慎，并對動物做好適當保暖工作，保持大鼠呼吸道暢通，切忌過量注射麻醉劑，以免造成實驗動物死亡。另外，實驗人員需每日檢查彈簧加力裝置，如發現裝置脫落或損壞須及時重新安裝，以保證矯治力持續作用。連續施加矯治力14 d后，小心拆除彈簧加力裝置。

1.2.3 注射尿源干細胞外泌體：以3 mL/kg的劑量給予大鼠腹腔注射濃度為10%的水合氯醛進行麻醉，麻醉后拆除加力裝置，將其固定于特制的鼠板上，實驗組大鼠于左側上頜第一磨牙近中根頰側黏膜轉折處，注射200 μL含100 μg(蛋白含量)尿源性干細胞外泌體(由西安齊岳生物公司提供)的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)，對照組大鼠則在相同位置注射200 μL PBS，兩組均每隔3 d注射1次，共注射5次[10]。

1.2.4 Micro-CT活體掃描：參照相關研究[11]改進micro-CT活體掃描方法。于注射尿源干細胞外泌體前及注射5次后分別使用micro-CT活體掃描儀(Latheta公司，型號：LCT200)對大鼠左側加力牙齒周圍牙槽骨和上頜第一、二磨牙進行掃描，掃描參數設置為8 W、114 kVp，厚度設置為10 μm，視角直徑設置為38.9 mm，整合時間設置為0.35 s，每只大鼠單次掃描時間為40 min，掃描時注意盡量調整大鼠頭部使其腭平面與地面平行。

1.3 觀察指標

1.3.1 牙根表面吸收陷窩體積測定：利用Mimics 10.0軟件，在micro-CT掃描得到的斷層處，采用三維凸包算法計算每只大鼠左側上頜第一磨牙的近中根分叉處至尖端的表面吸收陷窩體積[12]，測量3次取平均值。

1.3.2 骨小梁結構參數測定：根據micro-CT掃描圖像，在距離牙根表面200 μm處選取一700 μm×700 μm的區域為感興趣區域[13-14]，利用計算機對感興趣區域實施三維重建，測定骨小梁相關結構參數，包括骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular spacing，Tb.Sp)、骨體積/組織體積(bone volume/tissue volume，BV/TV)比值、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，測量3次取平均值。

1.3.3 蛋白免疫印跡法檢測：采用蛋白免疫印跡法檢測骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨保護素、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappaB ligand，RANKL)的表達水平。采用RIPA裂解液(Regal公司，生產批號：SJH0995)提取總蛋白后，采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；取下凝膠進行轉膜，恒流220 mA轉膜1 h，分子量40～60 kd恒流280 mA轉膜1 h；取下膜后用PBS洗滌4次，5 min/次；將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中37℃封閉1 h；用PBS稀釋一抗(1 ∶1 000)，膜在一抗稀釋液中4℃過夜封閉；次日將膜取出后用PBS洗滌4次，5 min/次；用含5%脫脂奶粉的封閉液稀釋二抗(1 ∶2 000)，膜在二抗中37℃反應1 h；反應完畢后，把膜取出后置于干凈的盒子中用PBS洗滌4次，5 min/次；以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參，利用電化學發光法顯影，曝光。采用Image J軟件檢測灰度值，以蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值作為所測蛋白質的相對表達量。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用成組t檢驗，組內注射前后比較采用配對t檢驗；計數資料以例數或百分比表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具體統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組牙根表面吸收陷窩體積的比較 注射尿源性干細胞外泌體前，兩組大鼠的牙根表面吸收陷窩體積比較，差異無統計學意義(P>0.05)。注射尿源性干細胞外泌體后，兩組大鼠牙根表面吸收陷窩體積均較注射前減小，且實驗組體積低于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組牙根表面吸收陷窩體積的比較(x±s，×107 μm3)

2.2 兩組骨小梁結構參數的比較 注射尿源性干細胞外泌體前，兩組大鼠的Tb.N、Tb.Sp、BV/TV比值、Tb.Th比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。注射尿源性干細胞外泌體后，實驗組大鼠的BV/TV、Tb.Th高于注射前水平及對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組骨小梁結構參數的比較(x±s)

組別nBV/TV比值注射前注射后t值P值Tb.Th(mm)注射前注射后t值P值對照組50.47±0.130.69±0.152.478 0.0380.10±0.020.13±0.051.246 0.248實驗組50.43±0.090.89±0.088.542<0.0010.09±0.010.22±0.039.192<0.001 t值0.5662.6311.0003.451P值0.5870.0300.3470.009

2.3 兩組BMP-2、BSP、骨保護素、RANKL相對表達水平的比較 實驗組的BMP-2、BSP表達水平均高于對照組(均P<0.05)，兩組的骨保護素、RANKL表達水平差異無統計學意義(均P>0.05)。見表3和圖1。

表3 兩組BMP-2、BSP、骨保護素、RANKL相對表達水平的比較(x±s)

圖1 兩組BMP-2、BSP、骨保護素、RANKL表達水平

3 討 論

導致牙根吸收的原因主要分為患者自身因素和治療相關因素，其中患者自身相關因素主要包括年齡、牙周狀態、牙齒形態、牙齒結構等，而治療相關因素主要包括矯治技術及其過程中矯治力的大小、矯治時間、牙移動方式以及拔牙與否等[15]。牙根吸收作為正畸治療的主要并發癥之一，其主要危害在于降低冠根比而破壞矯治效果，并影響患者口頜功能，造成面目美觀感缺陷，因此正畸治療醫師和患者均面臨較大的考驗[16]。移動性牙根吸收可分為3個等級：表層吸收(牙骨質表面吸收和改建)，即吸收僅發生在牙骨質表面，能夠快速進行改建和再生；深層吸收(牙本質吸收)，即吸收深度已到達牙本質淺層，僅針對吸收陷窩進行牙骨質樣物質修復，該修復過程無法使牙根狀態恢復正常；根尖吸收，根尖吸收后會引起牙根長度縮短，且無法進行修復[17]。有專家指出牙根吸收可見于大多數正畸患者，并且吸收程度較弱，僅涉及表層吸收，因此可自身完成修復[18]。本研究結果顯示，注射尿源性干細胞外泌體后，實驗組大鼠牙根表面吸收陷窩體積小于對照組，BV/TV、Tb.Th高于對照組(P<0.05)。說明通過局部注射干細胞可以促進移動性牙根吸收的修復。

BMP-2是BMP家族成員之一，具有極強的骨誘導活性，能夠促進牙槽骨細胞增殖再生；BSP是由成骨樣細胞分泌的糖蛋白之一，具有促進牙骨質再生的功能；骨保護素和RANKL是破骨細胞調節骨吸收的關鍵因子，促進破骨細胞凋亡并抑制其分化[19]。BMP-2、BSP的表達上調能夠發揮成牙骨質效應，促進牙骨質、牙槽骨增生，與BMP-2在牙根發育過程中發揮的作用類似。BSP作為成骨分化成熟的重要標志物之一，在牙周修復中的新生牙槽骨和牙骨質中均有表達，與BMP的表達水平一致[20]。BMP屬于轉化生長因子 β超家族的重要成員，具有誘導軟骨內成骨、胚胎發育、骨骼生長重建及再生等作用，其中BMP-2是最主要的功能蛋白之一。目前研究表明，BMP-2能夠誘導牙囊細胞表達成骨細胞特異性轉錄因子2、堿性磷酸酶、骨鈣素和BSP等相關基因，促進成骨/成牙骨質細胞向分化，從而引起牙槽骨、牙骨質和牙周韌帶的再生[21]；與其他轉化生長因子一樣，BMP-2能夠誘導 Smad 信號傳導通路等激活和核內轉錄，而這些信號傳導完全不同于 Wnt/β-肌動蛋白信號通路，但可能與其協同促進成骨/成牙骨質形成[22]。Zhang等[23]發現，BMP-2 能夠通過刺激低密度脂蛋白受體相關蛋白5 的表達來抑制 β-肌動蛋白的磷酸化，促進 β-肌動蛋白在前成骨細胞/成骨細胞中積累，從而促進成骨細胞分化，β-肌動蛋白的缺失導致 BMP-2 介導的成骨效應減弱。本研究結果還顯示，實驗組的BMP-2、BSP表達水平均高于對照組(P<0.05)，兩組的骨保護素、RANKL表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。提示尿源干細胞外泌體可促進移動性牙根吸收的修復，促進牙骨質再生，并且不會導致破骨細胞過度凋亡，但關于尿源干細胞外泌體可能促進移動性牙根吸收修復的具體機制還需進一步探究。

綜上所述，尿源性干細胞外泌體可促進移動性牙根吸收的修復，有效改善牙槽骨密度，并上調磨牙及其周圍牙槽骨組織中BMP-2、BSP表達水平上調，從而誘導牙周細胞的增殖分化。