玉米農桿菌轉化方法

司 冰

（河南省種子管理站，河南 鄭州 450046）

玉米作為世界上主要的糧食作物和工業原料之一，推動其轉基因技術研究與應用，是進行玉米功能基因組研究的有效方法，同時對確保國家糧食安全有重要意義。當前全球商業化的轉基因植物有107 種，其中，作為主流方法的農桿菌轉化和基因槍轉化分別占到了64%和31%，而利用DNA 直接轉移法和電激法的僅有5%[1]。農桿菌介導法在玉米遺傳轉化方面占有很大的優勢，單拷貝數、基因沉默比較少、性價比高等。

1 根癌農桿菌

根癌農桿菌是生活在植物根的表面依靠由根組織滲透出來的營養物質生存的一類普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌，是一種天然的基因轉化系統。它以雙子葉植物為天然宿主，雙子葉植物中的遺傳轉化已經取得了非常好的進展，但是對于玉米這樣的單子葉植物來說，遺傳轉化就沒有那么容易了，其遺傳轉化研究相對雙子葉植物落后。

根癌農桿菌攜帶有Ti 質粒，可以誘發植物產生冠癭瘤，而T-DNA 是根癌農桿菌Ti 質粒上的一段DNA序列,可以轉移并穩定整合到植物核基因組中。外源基因就是整合到T-DNA 上，通過T-DNA 的轉移整合到植物基因組中。Ti 質粒因為上述優點成為了導入外源基因的有效載體。農桿菌介導的遺傳轉化方面的研究已經日臻完善，發展成了植物基因工程中不可缺少的工具。因此，農桿菌被稱為自然界中的“天然遺傳工程師”[2]。目前，在玉米遺傳轉化中使用的農桿菌有3 種類型，不同的類型毒性不同，應根據受體的不同選擇不同的菌株，產生不同的轉化效率。這3 種類型分別是章魚堿型（以LBA4404 為代表）、胭脂堿型（以C58 菌株為代表）、琥珀堿型（以EHA101 和EHA105為代表）。

2 玉米農桿菌轉化的受體

2.1 以幼胚為受體

以前的研究多以胚性愈傷組織為受體材料，但是胚性愈傷組織只有極少數材料能穩定高效誘導出來，其誘導和分化受品種基因型的限制，加上胚性愈傷組織培養條件摸索，周期比較長，無菌操作繁瑣細致等原因，嚴重制約了玉米轉基因的研究進展，因此，玉米幼胚是較有效的轉化受體。

2.2 以愈傷組織為受體

在進行遺傳改良的過程中，通過組織培養獲得高頻率的胚性愈傷組織是轉化進行的前提條件，尤其是利用未成熟的幼胚誘導的愈傷組織。以前的學者將玉米的愈傷組織主要分為2 種類型：Ⅰ型：黃白色、整體結實、較硬、不易分開、生長慢、易發生器官的分化；Ⅱ型：乳黃色、蓬松、粒狀、生長較快、易產生胚狀體。Ⅱ型是目前玉米轉化的常用受體，具有較高的轉化頻率和再生頻率。但是很多自交系不易形成Ⅱ型愈傷組織，利用Ⅰ型愈傷組織進行農桿菌轉化是目前要克服的關鍵問題。

2.3 其他組織為受體

幼胚的供應受到季節的限制，不利于常年轉基因的進行；愈傷組織誘導操作的繁瑣也限制轉基因的發展。因此，有研究人員開始開發新的轉化受體，比如莖尖分生組織、成熟胚及莖尖分生組織誘導的胚性愈傷組織等。

3 影響農桿菌轉化效率的因素

3.1 農桿菌的選擇

農桿菌是進行遺傳轉化的有效工具，農桿菌的選擇在很大程度上決定著遺傳轉化效率的高低。選擇合適的農桿菌進行轉化是進行轉基因的前提。

3.2 培養基種類的選擇

目前，農桿菌侵染玉米的基本培養基主要是N6和MS 2 種，不同的自交系選擇不同的培養基，對每個培養基進行微調可以有效地改善轉化效率。

3.3 受體類型及來源

玉米遺傳轉化成功的一個關鍵因素就是受體材料，不同基因型、不同發育時期的玉米幼胚及愈傷組織對農桿菌侵染的感受性存在著差別，它的感受態直接關系著轉化成功與否。轉化受體一般要選擇生命力旺盛、易于分化、易于成苗的材料。不同的玉米品種其幼胚生長能力不同，分化愈傷的能力不同，有的玉米品種都不能誘導出愈傷組織。

3.4 共培養條件

侵染效率的高低很大程度上與共培養有關系，共培養培養基的選擇、培養時間的長短、培養溫度的高低都能影響侵染效率。酚類物質與農桿菌Vir 基因活化誘導有關，其中，乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮作用較強，在共培養的過程中加入乙酰丁香酮可以有效地提高轉化效率。

4 展望

世界范圍內轉基因作物已經擴展到四大作物（玉米、大豆、棉花和油菜）之外，為全球消費者和食品生產商提供了更多選擇，這些轉基因作物均已上市銷售，包括紫花苜蓿、甜菜、木瓜、南瓜、茄子、馬鈴薯和蘋果。而我國早在2009 年就給轉植酸酶基因玉米品種及抗蟲水稻品種頒發了安全證書，2019 年又擬批準為192 個植物品種目錄頒發農業轉基因生物安全證書，其中包括2 種轉基因玉米，即大北農生物技術有限公司的 DBN9936 和杭州瑞豐生物科技有限公司與浙江大學的雙抗12-5。轉基因技術作為一項應用型技術，在我國農業領域取得一定技術突破，將給種業龍頭企業、種業股傳遞利好信息。但是目前對于很多優良自交系來說，利用農桿菌進行遺傳轉化還是比較困難的，尤其是一些當前育種中使用的常規自交系。而且我國現在有很多特用玉米品種，對這些特用玉米品種進行遺傳改造還有一段路程要走，需要克服這些困難找到適合這些玉米品種的方法來進行遺傳修飾。