動脈粥樣硬化實驗室模型研究進展

竇曼曼，宋曉南，陳 盈綜述，邢英琦審校

心腦血管疾病在人群中的發病率越來越高，而動脈粥樣硬化是血管疾病發生的重要發病基礎[1]，所以研究其發病機制及其影響因素就顯得尤為重要[2]。對于科研工作者來說，成功建立動脈粥樣硬化模型是實驗開始的基礎。動脈粥樣硬化的模型主要包括動物模型和細胞模型[3]。動物模型主要使用老鼠、兔子、狗、豬和非人靈長類動物如猴子等造模。細胞模型主要使用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、淋巴細胞等造模，模擬動脈硬化形成的過程。本文針對這兩類模型目前的研究進展進行闡述。

1 動脈粥樣硬化的動物模型

1.1 兔子 兔子由于對膽固醇飲食敏感，高脂喂養后可以快速形成動脈粥樣硬化斑塊，而且在實驗中易操作，所以在動脈粥樣硬化模型中是一個比較成熟的模型動物[4]。在兔子的動脈粥樣硬化模型中，新西蘭大白兔是最常用的一個物種。選擇兔子作為動脈粥樣硬化模型時需要考慮的因素主要有：(1)在兔子動脈粥樣硬化模型中，由于其僅能形成早期脂質條紋，不能形成纖維斑塊，這與人體內可形成的纖維斑塊有一定差異；(2)其肝脂肪酶活性低，容易形成肝脂肪沉積，導致肝損傷[5]；(3)動脈粥樣硬化形成的周期較長，兔子在該造模周期中可能會發生不可控的情況；(4)兔子和人生理結構還是有一定的解剖差異，以至于用兔子作為動脈粥樣硬化模型研究出來的結論可能在人身上并不適用，所以選擇兔子造模的時候也要考慮到這一點[6]。用兔子制造動脈粥樣硬化模型有很多方法，包括高脂飼料喂養法、炎癥免疫法、內皮損傷法、基因工程法等[7]。現在就幾種常用的造模方式進行介紹。

1.1.1 內皮損傷法造模 在上述各種方法中，高脂喂養造成的動物高脂血癥是引起動脈粥樣硬化的基礎，各種方法導致內膜損傷，加快了動脈粥樣硬化的形成，節省了造模所需要的時間，由此建立的模型病變過程與人類動脈粥樣硬化的演變過程相似，所以是目前實驗中常用到的造模方式。內皮損傷的方法主要包括神經損傷、內皮干燥、球囊損傷等。現在研究中我們常使用高脂喂養聯合球囊損傷的方法，該方法可以制備很成熟的動脈粥樣硬化模型，現將該方法的技術操作要點介紹如下。

球囊損傷法：術前12 h禁食，不禁水。稱體重，給予25%烏拉坦注射液(4g/kg)耳緣靜脈注射，麻醉成功標志：呼吸深慢均勻，四肢癱軟，角膜反射遲鈍。麻醉成功后耳緣靜脈推注肝素鈉200 IU/kg，防止凝血。動物仰臥位固定于無菌手術臺，電推剪脫毛，常規外科消毒，鋪巾，沿頸正中線切開頸部皮膚，暴露皮下組織，縱行逐層鈍性分離肌肉、筋膜，分離頸動脈血管，保護伴行的神經，區分頸總動脈、頸內動脈以及頸外動脈后，應用動脈夾結扎頸總動脈和頸內動脈，眼科剪斜向頸外動脈剪一“V”型小口，將2.5 mm×15 mm球囊經頸外動脈送入頸總動脈至主動脈弓處，給予合適壓力，重復操作3-4次，隨后抽空球囊，緩慢撤出導管，無菌縫合線結扎頸外動脈，撤出動脈夾恢復血流。檢查有無出血、滲血，逐層縫合肌肉、皮質。應用800000 IU青霉素肌肉注射3 d預防感染。假手術組僅在解剖出頸總動脈后，用無菌縫合線在頸外動脈(遠心端處)打一死結，不進行球囊損傷，青霉素肌肉注射3 d預防感染[8，9]。

球囊損傷法除了損傷頸動脈外，球囊拉傷腹主動脈后并高脂喂養也是常用的方法之一[10]。10%水合氯醛腹腔注射(5 ml/kg)麻醉后，鈍性分離出右股動脈，注意保護股神經，損傷后容易出現術肢癱瘓。將球囊導管(大小：2.75 mm×15 mm)套進PTCA導絲(0.014)，導絲與球囊頭端并齊，連接壓力泵，插入前球囊表面用肝素鹽水濕潤減少阻力，抽負壓使其變硬，眼科剪在股動脈剪一小口，將球囊插入股動脈內，隨后先推送導絲約20 cm，固定導絲，沿導絲送入球囊導管約15 cm，6～8個標準大氣壓充盈球囊，下拉球囊至阻力明顯增大處即可停止，根據阻力大小可調整壓力泵數值，然后壓力泵恢復負壓，重新送入球囊，如此反復3次。術后結扎，逐層逢合傷口[11]。術后肌肉注射青霉素30萬單位防治感染，連續3 d[12]。

1.1.2 基因工程法造模 低密度膽固醇(LDL)在血管內皮聚集并激活一系列炎癥反應引發動脈粥樣硬化，LDL在動脈粥樣硬化發生發展過程中起著關鍵性的始動作用。當低密度膽固醇受體(LDLR)缺失時會引起體內脂質代謝障礙，造成脂質聚集，易形成動脈粥樣硬化。所以LDLR-/-兔子高脂喂養后易形成動脈粥樣硬化，可作為動脈粥樣硬化模型的造模動物[13]。

1.2 小鼠 鼠因為它快速繁殖，易于操作以及在合理的時間內形成血管硬化并易于監測，已經成為主要的物種來研究實驗性動脈粥樣硬化，[14]。載脂蛋白E(ApoE)是一種有明顯基因多態性的多功能蛋白，與脂蛋白的代謝有密切聯系，其缺失和變異都會引起體內代謝失常及功能紊亂，甚至引起一系列疾病和并發癥。小鼠由于在病理及組織學形態上與人類極其相近，高脂膳食喂養的小鼠是研究動脈粥樣硬化的常用動物模型之一[15]。在具體喂養方法上，對于普通小鼠，通常給予普通飼料喂養。對于ApoE-/-小鼠給予西方飲食(21%脂肪+0.15%膽固醇)喂養12 w后，其血脂水平顯著增高，在主動脈根部位置，管壁有增厚，斑塊也有明顯增多，表現出典型的動脈粥樣硬化病理特征。給予ApoE-/-小鼠高脂飼料(含18%氫化可可脂、0.15%膽固醇、7%酪蛋白、7%蔗糖和3%麥芽糊精)喂養8 w后，通過對小鼠心臟主動脈瓣行蘇木精-伊紅(HE)染色，證實動脈粥樣硬化模型制備成功[16]。高脂喂養后的apoE-/-雄鼠可在多個血管部位形成動脈粥樣硬化斑塊，尤其是主動脈根部，腹主動脈[17]。目前apoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化模型已經廣泛用于實驗[18]。apoE-/-小鼠也有一定的局限性。首先，脂質代謝不同，小鼠血漿中的膽固醇大部分是VLDL，而不是人體內觀察到的LDL。其次，ApoE由于其抗氧化、抗增殖和抗炎作用，被發現除了介導脂蛋白清除外，還可能具有額外的動脈粥樣硬化保護特性。這些問題都限制了apoE-/-小鼠用于實驗研究[19]。

另外，轉基因小鼠除了apoE-/-小鼠廣泛用于實驗中外，LDLR-/-小鼠也被用于動脈粥樣硬化實驗的模型。LDLR是肝細胞中的細胞表面受體，介導apoE的內吞作用，清除循環中膽固醇含量豐富的LDL顆粒，與野生型相比，LDLR-/-小鼠血漿總膽固醇水平增加了2倍[20]。LDLR缺失影響脂蛋白的代謝，由此建立起來的動脈粥樣硬化模型可以更大的歸因于脂代謝異常，在實驗研究中模型更穩定。

1.3 大鼠 大鼠作為模型動物也常被用于動脈粥樣硬化實驗。由于大鼠無膽囊的生理結構特點，造成大鼠對膽固醇等脂質吸收較少，單純的高脂飼料喂養只能造成大鼠體內脂質沉積，很難形成典型的動脈粥樣硬化。而高脂飲食造模時間較長[21]，高脂飲食有肝臟毒性，會使動物消瘦，造模期間有可能發生繼發感染，從而影響實驗的穩定性[22]。維生素D可以加快大鼠體內血鈣吸收，造成內膜損傷，所以高脂飼料結合維生素D能導致動脈粥樣硬化，一般采用維生素D3或D2。高脂飼料加定期注射維生素D3(6×105IU·kg-1)后8 w能加快形成動脈粥樣硬化[23]。高脂飼料結合維生素D的同時，加以手術機械損傷作用可形成與人類動脈粥樣硬化相似的較成熟的病變斑塊。機械損傷法主要包括球囊損傷法、電擊損傷法和動脈鉗夾法[24]。載脂蛋白E(apoE)參與脂蛋白代謝，在大鼠的脂質代謝中發揮著重要作用，故與小鼠類似，apoE-/-雄鼠高脂喂養后也能較快地形成動脈粥樣硬化[25]。LDLR-/-鼠或apoE-/-和LDLR-/-雙敲除(KO)鼠也被用于動脈粥樣硬化中，基因敲除后的大鼠可以引起體內高脂血癥，這對形成動脈粥樣硬化極其重要。大鼠的動脈粥樣硬化在頸動脈、腹主動脈中均可觀察到[26]。在造模技術發展的初始階段，我們經常使用大鼠來建造動脈粥樣硬化模型，但是隨著實驗技術的成熟，大鼠作為動脈粥樣硬化模型的缺點逐漸暴露出來。大鼠的生理結構和人體是有一定差別的，有些在大鼠身上驗證的動脈粥樣硬化理論在人體中并不適用，而且隨著小鼠在動脈粥樣硬化模型中的應用越來越成熟，大鼠模型的應用越來越少了。

1.4 其他類型的動脈粥樣硬化模型 除了兔子，小鼠和大鼠以外，還有一些動物被用于動脈粥樣硬化實驗中，如狗、豬、猴子等大型動物。靈長類動物由于與人類的生理結構比較相似，得出的結論在人體有較高的適用性，故用靈長類動物比如猴作為動脈粥樣硬化模型也是較常用到的[27]。但大型動物的缺點是造價昂貴，體型也較大，不好操作，所以這類動物在實際的動脈粥樣硬化造模使用時會受到限制。

總之，在動物動脈粥樣硬化造模過程中，會選用不同的方式，主要目的是通過不同方式造成動物動脈壁內脂質沉積，這些方式包括高脂喂養、手術方式造成的內皮損傷、基因敲除等手段。

2 動脈粥樣硬化的細胞模型

在動脈粥樣硬化相關實驗中，很多時候會涉及到細胞實驗，例如一些分子機制可能要在細胞上進行驗證，所以了解動脈粥樣硬化的細胞模型也很重要。人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)是動脈粥樣硬化細胞模型中常用到的一種細胞。與動物模型類似，在細胞中加入某種因子可以促進細胞內的炎癥反應，形成類似于動脈粥樣硬化的過程。如脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子(TNF)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)等都是典型的促炎因子[28]，都可以增加細胞內的炎癥反應。

LPS是動脈粥樣硬化實驗中常用于誘導細胞炎癥的一個試劑。在該模型中，LPS的濃度一般采用10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/mg不等，加入LPS 24 h后通過PCR或者蛋白質印記(Western blot)等實驗技術觀察到該模型中的炎癥因子如白介素、細胞間黏附因子-1(ICAM-1)、血管間黏附因子-1(VCAM-1)等炎癥因子的表達增加[29]。ox-LDL在誘導HUVEC的炎癥反應中常用的濃度10 μg/ml、50 μg/ml/100 μg/ml等濃度孵育24 h[30，31]，會檢測到炎癥因子增加。根據動脈粥樣硬化的形成原理，在細胞中加入這些因子，目的就是加快細胞內的炎癥反應或者脂質沉積等來加速動脈粥樣硬化的形成[32]。TNF-α的常用劑量是10 ng/ml、50 ng/ml培養6 h[33，34]。在細胞實驗中，除了可以直接加入一些促炎因子外，還可以引起通過細胞轉染在基因水平促進細胞動脈粥樣硬化的炎癥反應，如siTNF-α[35]。在細胞動脈粥樣硬化模型中，HUVEC是常用的一種細胞，除此之外，常用的細胞還有巨噬細胞(THP-1)[36]、樹突狀細胞(DC)[37]等，不同的細胞造模的方式相似，這些細胞均通過加入外部刺激因素促進細胞內的炎癥反應，被廣泛用于與炎癥相關的信號通路、藥物效應等。

3 小 結

動脈粥樣硬化的一個主要原因是內皮損傷和慢性炎癥，在動脈粥樣硬化的模型中，我們根據動脈粥樣硬化的形成原因對動物或者細胞進行干預，進而建造我們需要的模型。利用這樣的模型來驗證我們提出的跟動脈粥樣硬化相關的一系列問題，進而解決在臨床中可能遇到的一些問題，例如一些抗動脈粥樣硬化通路，為腦卒中等心腦血管疾病的治療提供思路[38]。在動脈粥樣硬化相關研究中，成功造模是實驗開始的前提，所以我們要根據自己想要的模型特點和要研究的課題來選擇合適的模型。