神經絲輕鏈在神經系統疾病中的研究進展

楊清燕，陳涓涓，吳 軍

神經絲蛋白(neurofilaments，NF)是神經元細胞骨架的重要成分，作用為維持神經元正常形態及保持神經纖維的彈性，防止斷裂，而神經絲輕鏈(neurofilament light，NFL)被認為是神經絲蛋白中最重要的一部分；實驗研究表明，NFL作為軸突損傷的標志物對于不同神經系統疾病，包括肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、多發性硬化(multiple sclerosis，MS)、創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)、亨廷頓舞蹈病(Huntington′s disease，HD)、急性缺血性卒中(acute ischemic stroke，AIS)等的診斷及用藥療效、預后評估等方面發揮著重要指導意義。本研究旨在對NFL的結構、功能、檢測及其在不同神經系統疾病的相關研究進展做一綜述。

1 神經絲蛋白和NFL的基本結構、功能概述

神經絲屬于中間絲蛋白家族的第Ⅳ類型[1]，是一種介于肌動蛋白(6 nm)和肌球蛋白(15 nm)之間的圓柱形細絲，其直徑約為10 nm[2]，是構成神經元軸突的特異性分子蛋白及神經元細胞骨架的重要成分。神經絲具有增加軸突結構穩定性，促進軸突徑向生長，增加軸突的直徑，提高軸突的脈沖傳導速度等作用[3]；另外，神經絲主要定位在成熟神經元的胞體和突起中，負責軸漿運輸，維持神經元正常形態及保持神經纖維的彈性，防止其斷裂[3]。

典型的神經絲位于軸突中心，呈平行排列，由NFL、神經絲中鏈(neurofilament middle，NFM)、神經絲重鏈( neurofilament heavy，NFH)和α-內切蛋白(α-internexin，α-INT)組成[2]。所有亞基都具有保守的α-螺旋棒狀結構域、可變的氨基末端和羧基末端區域，后者的長度賦予不同的分子量。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，將神經絲分為NFH(112.5 kDa)、NFM(102.5 kDa和145-160 kDa)、NFL(61.5kDa和70-86 kDa)與α-INT(55.4 kDa和58～66 kDa)[2]。神經絲的數量決定軸突直徑，神經絲蛋白在表達前軸突直徑較小，直到神經絲三組分(neurofilaments triplet proteins，NFTPs)大量表達后，軸突直徑才增大；有研究顯示，神經損傷后神經絲蛋白表達水平明顯下降，軸突直徑縮小，隨著軸突的再生，神經絲蛋白表達逐漸恢復 ，軸突直徑亦恢復正常[1]。由此可見，神經絲是軸突直徑大小的主要決定因素。神經絲在神經元胞體合成后被運輸至神經突起中，與微絲和微管共同組成神經細胞的骨架網絡。在軸突的運輸過程中神經絲發生磷酸化與去磷酸化，磷酸化的蛋白組裝到軸突神經絲網絡中，而原網絡中的蛋白則去磷酸化后成為游離狀態，新合成的神經絲蛋白不斷與原神經絲網絡中的蛋白發生新舊交換，以此進行自我更新[1，4-5]；NFL 是唯一可以自我組裝的亞單位，其在體外可自我組裝成70 nm 的纖維，而當 NFL缺如時，神經絲中鏈和神經絲重鏈都不能組裝成功能性神經絲，因而 NFL被認為是最重要的神經纖維絲成分[3，6]。

神經軸索損傷是各種神經疾病中導致永久性殘疾的病理基礎，在神經系統疾病管理中，軸突損傷的識別和量化可以提高診斷的準確性，同時可作為預后評估標準[2，7]。神經絲蛋白是一種在大直徑有髓軸突中高表達的神經元骨架蛋白，因此，炎癥、神經退行性變、創傷性或腦血管病等疾病引起中樞神經系統軸突損傷時，神經絲蛋白將釋放到細胞外液、腦脊液，并以較低濃度釋放到外周血液中[8]，釋放量的多少取決于軸突損傷的嚴重程度[7]。由于NFL是神經絲蛋白最豐富的亞基，也是可溶性的亞基，這使得NFL成為生物體液中最可靠的可測量的神經絲亞基[7]。近年來，NFL被作為神經軸索損傷的候選生物標志物，正受到越來越多的關注[2]。隨著科技日新月異的發展，檢測NFL的技術更加精準。臨床研究發現NFL與各類疾病有密切的關聯性，不管在疾病診斷、指導疾病預后、生物標記、疾病嚴重程度的預估、檢測藥物的有效性、預測預后等方面都有重要的指導意義。

2 NFL的檢測方法

NFL作為軸索損傷的生物標記物，準確測量其濃度可協助了解多種疾病的發展過程，由于各種疾病狀態導致的中樞神經系統軸突損傷，將NFL釋放到細胞外液、腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和外周血液中，外周血液中的NFL均較細胞外液、腦脊液低[2]；在臨床上腦脊液采樣為創傷性檢查，較外周血采樣不容易獲得；臨床上更加希望能夠用一種準確的測定方法來檢測外周血的NFL以指導臨床工作；既往的檢測方法主要用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)技術測定腦脊液中的NFL濃度，由于血液中的NFL濃度僅為腦脊液含量的1/40[7]，ELISA測定血液NFL濃度的靈敏度不夠[7]，難以達到要求。經過一系列的研究與驗證，從第一代的半定量免疫測定法，再到第二代夾心ELISA法，再到第三代電化學發光(electrochemi luminescence，ECL)技術，已經大大提高了分析靈敏度。近年來，隨著技術的發展，第四代單分子陣列(single molecular array，SiMoA)檢測技術在定量NFL方面的靈敏度分別比ELISA和ECL分析法高126倍和25倍[2，9-10]，使得在疾病狀態或生理條件下可以檢測到NFL濃度范圍，對血液中NFL水平進行可靠的定量測定，為科研和臨床提供便利。SiMoA技術是采用經典的雙抗夾心酶聯免疫吸附測定法實現極低含量的蛋白定量檢測，可實現單個分子的檢測，檢測靈敏度極高，通常在飛克(fg/mL)級別，比傳統的ELISA方法靈敏度高1 000倍。

3 NFL與神經系統疾病相關

3.1 NFL與運動神經元病(MND) MND是常見的神經系統退行性疾病，其特征性病理改變為上下運動神經元均存在變性及退化，其中ALS是最常見的亞型。Weydt等[11]研究顯示，ALS病人的腦脊液及血液中神經絲水平較正常人明顯增高；尤其是 ALS的早期NFL水平升高更為明顯，可能與病程早期神經元及軸突變性及退化速度更快相關。此外，NFL也可用于鑒別ALS與其他神經系統疾病及類MND疾病，其敏感性分別是88%和100%，特異性分別是92%和90%[12]。進展為ALS的下運動神經元病病人早期即存在血液及CSF中NFL水平增高，而Kennedy病及脊肌萎縮癥病人該指標正常，提示NFL有望作為臨床診斷標準之一，有利于縮短ALS確診時間。治療ALS的藥物有限，療效盡管不盡如人意，但仍有研究顯示，NFL具有評估ALS治療療效的潛力，基線高水平的血清NFL病人死亡危險比為3.91[95%CI(1.98，7.94)，P<0.001][13]，提示NFL水平對于評估ALS預后具有提示作用。NFL水平越高，疾病進展越快，總體存活時間越短[14-16]；

3.2 NFL與多發性硬化(MS) 磁共振(MRI)是目前唯一可識別MS新病灶的技術手段，其對于白質病變成像效果較好，但對于灰質病變顯示則欠佳，導致對MS灰質病變的低估，影響預后判斷。神經軸索損傷是決定MS病人長期功能殘疾最重要的決定性因素[17-20]，MRI不能準確檢測出神經軸索損傷程度，而NFL是近年來用于評估神經軸索損傷的敏感標志物。目前認為可通過測量NFL濃度來間接反映軸索損傷程度，從而評估功能預后。Barro等[20]還提出NFL是一種實時、易于測量的神經軸突損傷標志物，比顱腦MRI更全面。有研究證實，腦脊液中NFL和血清NFL具有密切的相關性[21]；一項納入259例MS病人的研究指出：MS病人NFL水平明顯高于健康對照組[20-21]。Huss等[22]在近期一項為期24個月納入34例復發緩解型MS(relapsing remitting MS，RRMS)病人的探索性隨訪觀察研究中，分別使用醋酸格雷替拉默和β-干擾素治療，通過觀察復發事件(expanded disability status scale，EDSS)評分和MRI相關參數，發現病人急性期血清NFL水平高于緩解期 ，無復發病人的血清NFL水平從第9個月開始降低，提示除MAR外，血清NFL的縱向測量可用于監測MS活動性和治療療效。早在1998年，Rosengren等首次使用第二代免疫分析法測量腦脊液中的NFL水平，指出腦脊液中的NFL與MS病人的殘疾程度(EDSS評分)、疾病活動程度及RRMS病人最后一次復發的時間具有相關性[23]，此后的數個大型臨床試驗中也將該結論不斷得到重復和驗證[20-21，24-28 ]。NFL還對疾病修飾治療(disease modifying therapy，DMT)效果有指導意義，持續DMT病人的血清NFL濃度低于未經治療病人，血清NFL水平高的病人未來復發和殘疾惡化的風險比血清NFL水平低的病人高[29]。

3.3 NFL與創傷性腦損傷(TBI) TBI具有較高的致死率及致殘率，早期確定損傷嚴重程度是調整治療措施的關鍵。Smith 等[30]認為，神經軸索損傷是TBI預后的主要決定性因素。NFL被認為是可以量化神經軸索損傷的一種敏感標志物。多項研究表明，腦外傷后腦脊液和血液中NFL濃度明顯升高；Shahim 等[31]研究證實，重型顱腦損傷后的前2周，腦脊液和血液中的NFL濃度與其他神經系統疾病或健康對照組相比急劇升高。研究顯示，血液NFL水平與腦脊液中NFL水平呈線性相關，利用Simona技術可以檢測血液內微量NFL水平升高，成為診斷輕微創傷性腦損傷(mild TBI，mTBI)的敏感指標[32]。另一項納入182例TBI 病人的研究指出，血清NFL水平與預后有相關性[33]。血液NFL可以準確地識別顱腦外傷后頭顱CT表現異常病人，有助于臨床醫生決定腦外傷病人是否需要接受頭部CT或MRI檢查[34]。目前的研究結果需要進一步研究來確定頭部創傷后血液NFL的動態變化，從而確定其測量的最佳時機。

3.4 NFL與亨廷頓病 亨廷頓病是一種常染色體顯性的神經退行性遺傳病，由HTT基因上的CAG重復擴增導致突變型亨廷頓蛋白(mutant Huntingtin，mHTT)的異常沉積而致病，目前尚無有效治療方法。識別及預測疾病進展和治療效果的敏感生物標志物，可為深入研究亨廷頓病帶來新的前景[35]。2017年一項納入201例攜帶HTT 突變個體的回顧性研究分析顯示：HTT突變攜帶者血漿中NFL濃度高于正常對照組[36]。另有研究證實，血漿中NFL濃度與HTT CAG重復計數之間的相關性；NfL濃度與殼核、尾狀體、灰質和白質在MRI測量的體積呈負相關，與認知功能及總體功能、腦萎縮有相關性，表明NFL濃度隨著亨廷頓病病人疾病嚴重程度的進展而增加[36-38]。另一項橫斷面研究指出，腦脊液和血清NFL可區分有臨床表現的亨廷頓病和正常人、臨床前期的亨廷頓病突變攜帶者，表明隨著對NFL的進一步了解，早期、靈敏的檢測NFL，可能有助于亨廷頓病療法的開發和臨床管理[35]。

3.5 NFL與AIS 缺血性腦卒中因神經元的丟失和反復發生的缺血事件導致嚴重殘疾。預測組織損傷或腦卒中復發的生物標志物可能有助于指導個體化腦卒中治療。近年來，研究發現NFL是缺血性腦卒中相關的潛在生物學標記物。一項大型前瞻性研究納入504例AIS和111例短暫性腦缺血發作(transient ischemic attack，TIA)病人發現，AIS病人血清NFL水平高于健康對照組[39]。此外，該研究還發現TIA病人血NFL水平低于AIS病人，表明NFL可以用來區分AIS和TIA病人[39]。2019年的一項研究指出，當血NFL濃度為4.9 pg/mL時，是鑒別AIS與TIA的最佳臨界值(敏感度73%，特異度80%)。AIS病人入院時臨床表現越嚴重，美國國立衛生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)評分越高，血NFL濃度越高[40-42]。不同卒中亞型血清NFL濃度也不同[43]，其中心臟栓塞或大動脈粥樣硬化型AIS病人血清NFL濃度最高[42]。Tiedt等[44]還發現血清NFL在腦梗死后第7天時濃度達到高峰，也有研究提出NFL的最高濃度出現在缺血性腦卒中后第3周[29]，但因沒有連續大樣本量的線性研究，NFL最高濃度出現時間節點目前尚無統一定論。NFL還可以預測腦梗死長期神經功能結局[43]。腦卒中后3個月內功能轉歸不良的病人入院時血NFL濃度高于轉歸良好的病人[41]。2019年發表在Stroke上的Uphaus等[40]研究也支持這一觀點。

4 結 語

NFL對于上述疾病雖然沒有特異性的診斷價值，但隨著血清NFL 檢測靈敏度不斷提高，其已經成為臨床醫師評估疾病軸索損傷嚴重程度的定量測量物質，臨床應用潛力逐漸被發掘，其作為神經系統疾病診斷、預測疾病活動性、預測疾病進展、隨訪預后、指導用藥和疾病監測等的生物標志物的證據日益增多。但真正可以應用于臨床工作之前，還需要進行一系列大型實驗研究來評估其有效性和實用性。NFL是未來臨床和研究中最有前途的生物標志物之一，其潛在的應用和未來的發展方向仍需要進一步探討。