開心散提取物抗焦慮作用及其化學成分研究

胡靈燕，張旗，蔡淑美，張爍，馮燕婷，陳玲凡，辛志明*

(1.福建醫科大學福建省新藥安全性評價中心，福建 福州 350122；2.福建醫科大學藥學院天然藥物學系，福建 福州 350122；3.福建醫科大學臨床醫學部，福建 福州 350122)

焦慮癥的發生率逐年上升，已經成為嚴重影響人們生活質量的主要精神疾病之一(約占11.4%)[1-2]，給社會和個人都帶來沉重的負擔。藥物治療是目前干預焦慮癥的主要手段之一，其中最為常用的藥物是苯二氮卓類(BZDs)和選擇性 5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)[3]，但由于其副作用和起效慢等不足在臨床應用中受到限制[4-6]，因此亟待研發安全有效的抗焦慮藥物。從傳統中藥尋找抗焦慮的活性成分并深入進行相關的關鍵科學問題探索研究是創制新型抗焦慮藥物的重要途徑。

開心散始載于唐代孫思邈《備急千金要方》卷十四“小腸腑·風虛驚悸第六”，方劑組成為“石菖蒲遠志各二兩，茯苓人參各三兩”，主治“主心氣不定，五臟不足，甚者憂愁悲傷不樂，忽忽喜忘，朝瘥暮劇，狂眩方”，是治療中醫情志病的經典方[7]。后世醫家主要用開心散治療心氣不足、神志不寧、健忘失眠、心怯怔忡等證，即西醫范疇的抑郁、焦慮癥狀、學習記憶障礙等[8]，可見開心散主要用于精神性疾病的治療。近年來，開心散對精神性疾病治療的研究主要集中于抗抑郁和改善老年癡呆癥的研究，而開心散對焦慮障礙的治療作用尚未闡明。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 藥品與試劑

開心散中成分人參、茯苓、遠志、石菖蒲(北京同仁堂藥店)；地西泮(規格：2 mL/10 mg，天津金耀藥業有限公司)；5-HT試劑盒(批號：C0101070172，武漢華美生物工程有限公司)；色譜乙腈(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

1.3 儀器設備

酶標儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)；Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(Waters 公司)；色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(1.8 μm，3 mm×150 mm)，ZORBAX SB-Aq(5 μm，4.6 mm×250 mm)；高效液相色譜串聯二維線性離子阱-靜電場軌道阱質譜儀LTQ-Orbitrap XL型(美國賽默飛世爾科技公司)。

2 方法

2.1 開心散提取物的制備

開心散(KXS)：人參18 g，茯苓18 g，遠志12 g，石菖蒲12 g。10 倍量60% 乙醇回流提取3次，每次1 h，過濾，濾液合并，減壓濃縮即得復方的提取物，濃度為0.9 g/mL。

2.2 開心散提取物抗焦慮作用

將大鼠隨機分為5組，每組10只，分別為模型組,陽性藥組(地西泮1 mg/kg),開心散(KXS)的高劑量(12 g/kg)、中劑量(6 g/kg)、低劑量(3 g/kg)組。將每只大鼠放在電擊儀(30 cm× 24 cm×21 cm)中適應5 min。隨后，以30 s的間隔持續刺激2 s，連續10次進行選擇性足底震擊(0.5 mA)[9]，連續刺激7 d后，各組大鼠給藥7 d后進行高架十字迷宮測試和曠場試驗，本實驗選用高架十字迷宮實驗中的開臂次數百分比和開臂滯留時間百分比以及曠場實驗中的中央區滯留距離作為評價藥物抗焦慮作用的指標；并用酶聯免疫吸附法對大鼠腦組織5-HT的含量進行測定，以探討其抗焦慮作用情況。

2.2.1 高架十字迷宮實驗

灌胃給藥第7 d，給藥1 h后進行高架十字迷宮實驗。實驗前先將大鼠置于開場中活動5 min，然后將大鼠置于迷宮中央，使其頭部正對其中一個開放臂，用計算機跟蹤記錄大鼠在高架十字迷宮上的活動情況，記錄時間為5 min。以大鼠的開臂次數百分比(OE%)即開臂次數/(開臂次數+閉臂次數)和開臂滯留時間百分比(OT%)即開臂滯留時間/(開臂時間+閉臂時間)作為評價藥物抗焦慮作用的指標[10]。

2.2.2 曠場實驗

曠場實驗采用四聯立方體木敞箱(100 cm×100 cm×50 cm)，周壁與底面為黑色，底面分為中央區與外周區且兩區域面積相同。曠場實驗開始前5 min將大鼠移至測試區以適應陌生的實驗環境。實驗時，將大鼠置于礦場實驗中央，然后開始計時，每組5 min。通過安置的攝像監測系統以及計算機安裝的動物行為學軟件記錄其在5 min內滯留于中央區的距離百分比[11]。

2.2.3 腦組織取材

行為學測試結束后，各組大鼠(2%戊巴比妥鈉，40 mg/kg)麻醉后，腹主動脈取血，立即斷頭，迅速取出大腦，用冰生理鹽水沖洗除去血液，濾紙拭干，快速在冰盤上分離出海馬組織，放入勻漿器中加生理鹽水冰浴中磨成勻漿液，4 ℃高速離心20 min(離心速率為18 000 r/min)，取上清液放-80 ℃超低溫冰箱中保存待測。

2.2.4 海馬組織中5-HT水平的測定

采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測大鼠5-羥色胺(5-HT)水平。往預先包被5-HT和NE 抗體的ELISA檢測試劑盒的包被微孔中，依次加入標準品、標本、HRP標記的檢測抗體，經過溫育洗滌。用底物 TMB 顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸性終止液的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的5-HT含量呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定樣品的吸光度(OD值)，計算樣品濃度，具體操作參照ELISA說明書步驟。數據用 SPSS18.0 統計軟件進行分析處理，組間比較采用單因素方差分析。

2.3 開心散提取物的色譜條件

精密稱量開心散提取物0.129 4 g，用甲醇超聲溶解，定容于10 mL容量瓶，得到濃度為12.94 mg/mL開心散的供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，待用。色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(1.8 μm，3 mm×150 mm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～5 min，3% A；5～7 min，3～8% A；7～10 min，8% A；10～17 min，8～15% A；17～20 min，15～18% A；20～25 min，18～25% A；25～28 min，25～30% A；28～32 min，30% A；32～36 min，30～32% A；36～37 min，32～40% A；37～42 min，40～48% A；42～50 min，48～80% A；50～52 min，80～85% A；52～58 min，85 A。流速：0.3 ml/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：254 nm。

2.4 開心散提取物的質譜條件

電噴霧離子源(ESI)，LTQ-Orbitrap質譜儀。電離參數設置如下：負離子模式；方法設置如下：鞘氣(氮氣)流量為30 arb，輔助氣體(氮氣)流量為5 arb，噴霧電壓4.0 kV，毛細管溫度為350 ℃，毛細管電壓為25 V。掃描方式為全掃描，質量掃描了m/z 200～2 000的質量范圍。將碰撞誘導解離(CID)的碰撞能量調整為最大強度峰的30%，前體離子的分離寬度為m/z 2.0 Da。啟用了動態排除以防止重復，并且將重復計數設置為5，動態重復時間為30 s，動態排除時間為60 s。

2.5 統計學處理

統計學處理采用SPSS17.0軟件，以均數±標準差表示所有數據，對于各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P≤0.05作為評定差異有統計學意義的標準。利用Thermo Xcalibur軟件解析其化合物，鑒定時，綜合對比化合物的歸屬、母離子、子離子的信息，并參考相關研究的文獻，確定化合物的結構。

3 結果

3.1 開心散(KXS)提取物對大鼠焦慮行為的影響

高架十字迷宮結果顯示，與模型組比較，陽性組地西泮能增加大鼠在高架十字迷宮的開臂時間OE%值(P<0.05)，表明造模成功。與模型組比較，開心散提取物高劑量組(12 g/kg)和中劑量(6 g/kg)能增加大鼠在高架十字迷宮的開臂時間OE%值(P<0.05)，顯示出開心散提取物高劑量、中劑量對大鼠的抗焦慮作用，尤其以開心散提取物高劑量的抗焦慮作用更為明顯。與對照組相比，開心散提取物低劑量組(3 g/kg)開臂時間百分比也增加，但沒有統計學意義。此外，與對照組相比，地西泮和KXS提取物(12、6和3 g/kg)能夠顯著提高大鼠的開臂次數(P<0.05)。同時，表明KXS具有明顯的劑量效應關系，見表1。

曠場實驗結果顯示，與模型組比較，地西泮能提高大鼠進入曠場中央區域的距離OD%值(P<0.05)，表明造模成功。與模型組比較，開心散提取物組能增加大鼠在中心區域的距離OD%值，但沒有統計學差異，見表1。

3.2 大鼠海馬5-HT檢測結果

5-HT檢測結果顯示，與模型組比較，地西泮組與開心散給藥組(3 g/kg，6 g/kg，12 g/kg)能夠顯著升高大鼠腦內神經遞質5-HT的含量，尤其高、中劑量組的升高程度最顯著(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見表1。說明開心散提取物組能夠顯著提高焦慮模型大鼠腦內神經遞質5-HT的含量，證實其具有較好的抗焦慮作用。

表1 開心散干預大鼠焦慮模型情況比較

3.3 開心散提取物的成分分析

通過摸索得到的洗脫條件，建立了開心散提取物在254 nm下的色譜圖(見圖1)以及UPLC-DAD-ESI-MSn總離子流圖(見圖2)。根據質譜裂解信息以及文獻對比[12-15]，共解析圖譜得到39個化合物，包括11個遠志皂苷類化合物，12個遠志寡糖酯類化合物，3個蔗糖酯化合物，3個遠志酮化合物，3個人參皂苷類化合物，7個三萜烯酸類化合物，分別為西伯利亞糖A5、西伯利亞糖A1、Tenuifoliose G、Tenuifoliside A、sibiricaxanthone A、7-O-methylmangiferin、polygalaxanthone Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、Tenuifoliose G、Tenuifoliside A、Tenuifoliose L、Tenuifoliose F、Tenuifoliose K、Tenuifoliose C、Tenuifoliside C、Tenuifoliose J or I、Tenuifolise B、Tenuifoliose H、Tenuifoliose A、Ginsenoside Rb1、Ginsenoside Ro、Ginsenoside Rd2、Senegin IV、Onjisaponin O、Onjisaponin L、Senegin Ⅲ、Onjisaponin R、Polygalasaponin XXXⅡ、Onjisaponin E、Onjisaponin F、onjisaponin G、onjisaponin Gg、onjisaponin W、poricoic acid H、3β-p-hydroxybenzoyldehydrotumulosic acid、16α-hydroxytrametenolic acid、tumulosic acid、poricoic acid C、3β-hydroxy-16α-acetoxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid、3-epi-dehydropachymic acid。

圖1 開心散提取物的UPLC色譜圖

圖2 開心散提取物UPLC-MS-MSn總離子流圖

4 討論

開心散始載于唐代孫思邈的《備急千金要方》，用于治療失眠，精神障礙和病態健忘。研究表明，開心散可以通過增加MT1表達和增加BDNF表達來改善抑郁樣行為[16]。然而，開心散提取物抗焦慮作用以及機制研究尚未闡明。本課題選用被廣泛用于評估嚙齒動物焦慮相關行為的高架十字迷宮和曠場實驗作為評價指標，結果表明開心散提取物(12 g/kg和6 g/kg)改善了焦慮樣行為，表現為能夠顯著增加大鼠在高架十字迷宮的開臂時間百分比和開臂次數(P<0.05)，以及能夠相應增加大鼠在曠場實驗的中央區域距離。此外，開心散提取物(12 g/kg，6 g/kg和3 g/kg)可以顯著上調海馬5-HT水平(P<0.05)，并呈劑量依賴性。長期以來，5-羥色胺(5-HT)系統參與了焦慮的調解，5-HT也是現有抗焦慮藥物的主要目標[17]?？傊?，KXS提取物可能通過其5-羥色胺(5-HT)系統改變了這些行為障礙而具有抗焦慮作用。

為了探索開心散提取物的藥效成分，筆者建立了UPLC色譜圖。在此基礎上，筆者進一步通過UPLC-DAD-ESI-MSn并對比相關文獻，鑒定了39個化學成分，包括11個遠志皂苷類化合物，12個遠志寡糖酯類化合物，3個蔗糖酯化合物，3個遠志酮化合物，3個人參皂苷類化合物，7個三萜烯酸類化合物。在先前的研究基礎上[12]，筆者進一步鑒定出7種三萜酸。原因可能是本研究中開心散提取物是用60%乙醇提取的，而三萜酸更易被提取。此外，據報道人參皂苷和遠志皂苷等具有抗焦慮作用或抗抑郁作用[18]。