蘇木乙酸乙酯提取物對慢性病毒性心肌炎小鼠心臟功能及心肌組織p38MAPK mRNA的影響

陳會君，李力恒，徐倩，張晶，劉志平，周亞濱*

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

慢性病毒性心肌炎的發病機制尚未完全闡明，主要包括病毒核酸在心肌中低水平持續復制而引起的直接心肌損傷以及由病毒激活并維持的免疫反應而導致的間接心肌損傷。其中免疫損傷、細胞凋亡、心肌纖維化等是慢性病毒性心肌炎的主要機制[1]。p38MAPK通道是諸多引起心肌纖維化的因素的共同通路[2-3]。

慢性病毒性心肌炎的治療一直是困擾臨床醫生的難題，近年來，免疫抑制劑如腎上腺皮質激素、干擾素、FK506、環孢素、IL-6等的應用雖取得了一定的臨床療效，但同時也存在難以克服的局限性。由于免疫反應在慢性病毒性心肌炎的發病及演變過程中起重要作用，而課題組在前期的研究中證實了中藥蘇木具有明確的免疫抑制作用，并且確定乙酸乙酯提取物是其免疫抑制的有效部位，故本研究選用蘇木乙酸乙酯提取物作為治療藥物，通過觀察其對慢性病毒性心肌炎小鼠心臟功能、心肌組織p38MAPK mRNA的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

近交系純種Balb/c健康雄性小鼠145只，SPF級，3～4周齡，體質量(10±2)g，由復旦大學上海醫學院實驗動物部提供，動物合格證號：SYXK(滬)2009-0082。鼠糧為清潔級小鼠生長繁殖顆粒飼料，每籠10只，層流架內分籠飼養于溫度為20 ℃～24 ℃、濕度為50%～55%的屏障環境中。飼養符合《實驗動物飼養和使用指南》相關規定。

1.1.2 實驗病毒

柯薩奇B3病毒(CVB3)Nancy株，由復旦大學附屬中山醫院衛生部病毒性心臟病重點實驗室饋贈。半數組織培養感染量(TCID50)為103.75,培養方法見參考文獻[4]。

1.1.3 實驗藥物

1.1.3.1 蘇木乙酸乙酯提取物

蘇木原材，購于黑龍江省藥材公司，產于云南省。蘇木提取方法參見文獻[5]。將蘇木乙酸乙酯提取物溶于0.2%羧甲基纖維素鈉溶液中，制備成濃度為70 mg/mL蘇木乙酸乙酯提取物溶液。

1.1.3.2 環孢素軟膠囊

規格為25 mg/粒，華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司生產，國藥準字H10960009，批號：20120501。將根據實驗動物與人的體表面積比例系數換算，確定Balb/c小鼠每日服藥劑量18.2 mg/kg。刺破膠囊，擠出油狀藥物，溶解到0.2%羧甲基纖維素鈉溶解中，配制成濃度為3.0 mg/mL、2.0 mg/mL的溶液，室溫保存備用。

1.1.3.4 羧甲基纖維素鈉

將20 mg溶于10 mL蒸餾水中，配制成0.2%的羧基纖維素鈉溶液，室溫保存備用。

1.1.4 實驗試劑

PCR引物：P38MARK 上游：5′-CGTTTGTGCCTATTGTTCTTGTT-3′，下游：5′-TGATCCATTGCTTTACCGTCTAC-3′；Beta Actin上游：5′-CCATTGAACACGGCATTG-3′，下游：5′-TACGACCAGAGGCATACA-3′。

1.1.5 主要儀器

Vevo 770超聲診斷儀(加拿大VisualSonics公司)；6010可見-紫外分光光度計(美國安捷倫上海分析器廠)；轉印電泳儀(北京六一儀器廠)；7500型定量PCR儀(美國應用生物系統公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型復制

雄性Balb/c小鼠145只，隨機抽取10只作為空白對照組，其余135只小鼠用于模型復制。將TCID50為103.75的CVB3用MEM Eagle稀釋至10-5，用1 mL注射器抽取,腹部推注病毒稀釋液0.1 mL，第15天采用如上方法給每只小鼠注射病毒稀釋液0.15 mL，第30天給每只小鼠注射病毒稀釋液0.2 mL?？瞻讓φ战M于相應時間點腹腔注射同體積的MEM Eagle液。于實驗第15、30、45天各脊髓脫臼法處死2只模型小鼠，HE染色觀察心肌病理組織，出現了典型的慢性心肌炎的病理變化，證實模型成功。第45天共計存活77只小鼠，隨機抽取75只作為慢性病毒性心肌炎模型小鼠進行實驗。

1.2.2 實驗分組及給藥

共分為4組,將10只腹腔射MEM Eagle液的小鼠作為空白對照組；將75只造模成功的病毒性心肌炎小鼠，隨機分為3組，即模型對照組、環孢素組、蘇木乙酸乙酯提取物組(簡稱蘇木組)，每組25只。

空白對照組和模型對照組小鼠每天灌服羧甲基纖維素鈉溶液0.2 mL。蘇木組小鼠灌服700 mg/(kg·d)蘇木乙酸乙酯提取物羧甲基纖維素鈉溶液，每天灌胃量為0.2 mL。環孢素組小鼠灌服30 mg/(kg·d)環孢素羧甲基纖維素鈉溶液，先灌胃10 d；然后改為20 mg/(kg·d)環孢素羧甲基纖維素鈉溶液，灌胃10 d。每天灌胃量為0.2 mL。

以上溶液羧甲基纖維素鈉的濃度均為0.2%。灌胃藥物每天灌胃前隨用隨配。各組Balb/c小鼠均于實驗第45天開始灌胃。每天灌胃1次，連續灌胃20 d。

1.2.3 標本采集

于實驗第65天采用頸椎脫臼的方法處死全部存活的小鼠進行標本采集。給小鼠做常規固定、消毒、開胸，取出心臟后立即放入4 ℃預冷的生理鹽水中，將殘余血液沖洗干凈，再用濾紙吸干，觀察心臟外觀，用電子天平稱量心臟重量。然后沿左室長軸將心臟分成兩份，一份用10%中性福爾馬林溶液固定，用于HE、VG染色和免疫組化檢查。一份液氮冷凍后放入-70 ℃低溫冰箱凍存，用于PCR檢測。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 小鼠一般狀態

觀察各組小鼠在實驗過程中的精神、活動狀態、飲食飲水、毛色形態變化等狀況，并詳細記錄小鼠的死亡情況。

1.3.2 超聲心動圖檢查

灌胃結束后，對各組小鼠進行心臟超聲檢查。

1.3.3 Real-Time PCR法觀察心肌組織p38MAPK mRNA

灌胃結束后，取材心臟對各組小鼠心肌組織進行p38MAPK mRNA測定。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 小鼠的一般狀態

空白對照組小鼠皮毛光澤，肌肉充實，正常飲食、活動，明顯體重增加，無死亡。慢性病毒性心肌炎模型小鼠首次注射病毒第3天開始出現精神萎靡，飲食下降，消瘦，皮毛凌亂、毛糙無光澤，易激惹或對外界反應淡漠，第4天開始出現死亡，共計存活小鼠77只，隨機取75只作為病毒性心肌炎模型小鼠進行灌胃。灌胃后，模型小鼠仍精神萎靡，飲食不佳飲，皮毛凌亂，消瘦。5 d后，蘇木組小鼠的狀態明顯好于模型對照組和環孢素組。灌胃期間，模型對照組小鼠死亡7只，環孢素組死亡12只，蘇木組死亡5只。

2.2 小鼠心臟超聲檢查結果

病毒感染后各組小鼠心腔都有不同程度擴大,心室壁活動度減弱,左室收縮末期與舒張末期內徑不同程度增大，左心室功能減退。結果見圖1。與空白對照組相比, 模型對照組小鼠LVEDD與LVESD顯著擴大(P<0.01)；與模型對照組相比，環孢素組和蘇木組的LVEDD和LVESD均明顯減小(P<0.05)；蘇木組與環孢素組比較無顯著差異(P>0.05)。與空白對照組相比,模型對照組小鼠左室EF與FS值顯著下降(P<0.01)；與模型對照組相比，環孢素組與蘇木組小鼠的左室EF與FS值均明顯增加(P<0.05)；蘇木組與環孢素組比較無顯著差異(P>0.05)。見表1、表2。

圖1 各組小鼠心臟彩超情況

表1 各組小鼠左室舒張期末、收縮期末內徑比較

表2 各組小鼠左室收縮功能比較

2.3 小鼠心肌組織p38MAPK mRNA表達

與空白對照組相比，模型對照組的p38MAPK mRNA表達明顯增加(P<0.05)；與模型對照組相比，環孢素組、蘇木組的p38MAPK mRNA表達均明顯降低(P<0.05)；環孢素和蘇木組的p38MAPK mRNA表達無明顯差異(P>0.05)。結果見圖2。

注：與空白對照組比較，▲P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05。

3 討論

慢性病毒性心肌炎是西醫學病名，根據其主要臨床表現可將其歸屬于“心悸”“胸痹”范疇；在國家標準《中醫臨床診療術語》中稱之為“心癉”。本病病位在心，外感六淫是本病的主要致病因素，其中尤以風熱、風溫最為常見。病機主要為溫熱余邪留戀，傷及氣陰，瘀血阻絡。

蘇木，性味甘、咸、辛、涼，歸心、肝、脾、胃經，可活血散瘀、消腫止痛?！缎滦薇静荨吩疲骸爸髌蒲?，產后血脹悶欲死者。”《本草求真》中對蘇木有“功用有類紅花，少用則和血，多用則破血”的記載。古代醫家多用于治療跌打損傷，痛經，血滯經閉，產后瘀血腹痛，心腹疼痛，癰腫瘡毒等。蘇木是課題組上世紀90年代從眾多活血化瘀藥中篩選出的免疫抑制作用較為突出的中藥材之一。

本實驗中，病毒感染各組小鼠心腔都有不同程度擴大, 心室壁活動度減弱,左室收縮末期與舒張末期內徑不同程度增大，左心室功能減退。其中模型對照組小鼠左室明顯擴大，射血分數與縮短分數明顯降低，說明病毒感染后小鼠心肌組織損傷嚴重，呈慢性病毒性心肌炎、心衰甚至向擴張型心肌病發展[6-7]。與模型對照組相比，環孢素組與蘇木組左室舒張末與左室收縮末徑都明顯減少，射血分數和縮短分數卻明顯升高，表明蘇木乙酸乙酯提取物和環孢素A均具有改善慢性病毒性心肌炎小鼠心功能的作用，二者比較無顯著差異。結果表明，蘇木乙酸乙酯提取物在改善病毒性心肌炎小鼠心功能方面療效肯定，這可能與其活血祛瘀，消腫止痛，減輕小鼠心肌病理損傷，抑制心肌纖維化有關。

p38MAPK在多種心血管疾病的發生發展過程中起著十分重要的作用。p38MAPK與心室重構關系密切[8-9]，當心肌細胞受到刺激后產生炎癥因子，活化p38MAPK通路，誘導心肌蛋白合成，心肌細胞肥大，進而發生心肌肥厚[10-11]。本實驗中，與空白對照組相比，模型對照組的p38MAPK mRNA表達明顯增加，表明病毒感染后，p38MAPK通道受到病毒刺激而被活化，被活化的p38MAPK加速CVB3的復制，加重炎癥反應，促進心肌細胞凋亡和成纖維細胞活化，并誘導細胞外基質膠原增生，而出現心肌纖維化的病理損傷，導致心肌肥厚，心室重構，心臟功能受損，嚴重者出現心衰的表現，超聲檢查中亦可見心功能減退。而蘇木組的p38MAPK mRNA表達明顯降低，表明蘇木乙酸乙酯提取物可以抑制p38MAPK活化，切斷p38MAPK通道，抑制病毒的持續復制，減少細胞凋亡，抑制成纖維細胞表型發生轉變，減弱其分泌細胞外基質的能力，從而最終減輕或抑制心肌纖維化，改善心功能。

本研究證實蘇木乙酸乙酯提取物能夠改善慢性病毒性心肌炎小鼠心肌的心臟功能，抑制心臟肥大；蘇木乙酸乙酯提取物能夠抑制慢性病毒性心肌炎小鼠心肌組織p38MAPK mRNA的表達，這可能是其治療慢性病毒性心肌炎的機制之一。