基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)牛膝對(duì)成骨細(xì)胞影響的潛在分子機(jī)制研究

張佳旭，郭新月，李曉亮，林曉婷，李嘉楠，楊柳

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身性骨代謝性疾病,以骨量丟失和骨組織微觀結(jié)構(gòu)的損傷為特點(diǎn)[1]。目前公認(rèn)的OP發(fā)病機(jī)制之一是破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)介導(dǎo)的骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破,導(dǎo)致骨吸收大于骨形成,骨量下降[2]。現(xiàn)階段，在治療OP的藥物中，促進(jìn)骨形成的藥物只有甲狀旁腺激素是被美國(guó)食品藥物管理局唯一批準(zhǔn)的[3]。但是甲狀旁腺激素由于可能會(huì)導(dǎo)致骨肉瘤,這使甲狀旁腺激素的臨床使用受到了限制[4]。OB主要由內(nèi)外骨膜和骨髓中基質(zhì)內(nèi)的間充質(zhì)始祖細(xì)胞分化而來(lái)，能特異性分泌多種生物活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)并影響骨的形成和重建過(guò)程[5]。OB參與了骨基質(zhì)成分如Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，在骨質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[6],此外還具有影響鈣離子和磷酸鹽在骨化中心濃聚并誘導(dǎo)骨基質(zhì)成分礦化的功能，以及會(huì)產(chǎn)生與體內(nèi)基質(zhì)礦化有關(guān)的骨鈣蛋白、骨橋蛋白和骨唾液酸糖蛋白[7]。因此OB的生長(zhǎng)、分化和活性的改變?cè)谝恍┕强瓢l(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

牛膝，為莧科植物牛膝(RAB)的干燥根。冬季莖葉枯萎時(shí)采挖，除去須根和泥沙，捆成小把，曬至于皺后，將頂端切齊，曬干。分布于全國(guó)，在有些地區(qū)有大量栽培品種[8]。具有逐瘀通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、利尿通淋、引血下行的功能。用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、腰膝酸痛、筋骨無(wú)力等。《名醫(yī)別錄》中記載RAB“療傷中少氣，男子陰消，老人失溺，補(bǔ)中續(xù)絕，益精利陰氣，填骨髓，止發(fā)白，除腦中痛及腰脊痛，婦人月水不通，血結(jié)。”RAB是補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之要藥，既往研究也表明RAB具有抗骨質(zhì)疏松的作用，RAB當(dāng)中的甾體對(duì)于OB的增殖與分化也有很大的影響，但是RAB對(duì)OB影響的潛在在分子機(jī)制仍然有待于具體研究[9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來(lái)新興的一門學(xué)科，它基于前沿的科學(xué)研究成果和文獻(xiàn)資料，以“疾病-基因-靶標(biāo)-藥物”概念為基礎(chǔ)，以系統(tǒng)、綜合的觀點(diǎn)看待藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和作用，從而揭示藥物對(duì)人體的復(fù)雜的作用機(jī)制[10-11]。這與中藥多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的機(jī)制是高度統(tǒng)一的[12]。因此，本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討RAB對(duì)于OB影響的潛在可能機(jī)制，為今后的RAB現(xiàn)代藥理研究以及骨科疾病的靶向藥物研究提供一定的參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)庫(kù)：TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、UniProt(https://www.uniprot.org)、Gene Cards(https://www.genecards.org/)、Dig See(https://omictools.com/digsee-tool)、OMIM(https://www.omim.org)、String(https://string-db.org/cgi/input.pl)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)。

軟件：在線Venn圖繪制工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)、Cytoscape、R、RStudio。

1.2 方法

1.2.1 活性成分的篩選與活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索RAB當(dāng)中的化學(xué)成分，篩選出口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%，藥物相似性(Drug-likeness,DL)≥0.18的化學(xué)成分作為RAB的主要活性成分。結(jié)合文獻(xiàn)查閱結(jié)果，整理添加符合要求的化合物。對(duì)其候選化合物名稱進(jìn)行檢索并整理對(duì)應(yīng)的靶蛋白。將整理好的靶蛋白導(dǎo)入到UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo Sapiens”，獲取每個(gè)靶蛋白所對(duì)應(yīng)的靶基因，最后將得到的靶基因進(jìn)行合并，保留唯一項(xiàng)，所得結(jié)果即為RAB活性成分的靶點(diǎn)。

1.2.2 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以“osteoblast”為關(guān)鍵詞在Gene Cards、Dig See以及 OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與成骨蛋白相關(guān)的靶點(diǎn)，合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果。將上述得到的靶點(diǎn)和檢索結(jié)果經(jīng)過(guò)在線Venn圖繪制工具映射獲得RAB影響OB的潛在作用靶點(diǎn)。建立活性成分-作用靶點(diǎn)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)，并導(dǎo)入到Cytoscape軟件中，構(gòu)建RAB影響OB蛋白拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.3 RAB影響OB關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

為了進(jìn)一步研究RAB影響OB的可能作用機(jī)制，將RAB的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到 String數(shù)據(jù)庫(kù)中,限定研究物種為“Homo Sapiens”, 選擇可信度最小值為0.900，獲得蛋白互作關(guān)系，將所得數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到Cytoscape中，構(gòu)建蛋白互做網(wǎng)絡(luò)圖，得到RAB影響OB的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.4 基因富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO(Gene ontology)功能富集分析，研究RAB影響OB的主要生物功能；對(duì)潛在的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，研究RAB影響OB主要信號(hào)通路。將獲得的富集結(jié)果利用R語(yǔ)言對(duì)主要生物功能進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分的篩選與活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

結(jié)合文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果，得出符合條件的化學(xué)成分主要包括β-蛻皮甾酮(β-ecdysterone)、牛膝苷(bidentatoside)、刺苷A(Spinoside A)、小檗堿(berberine)和漢黃芩素(wogonin)等20個(gè)化學(xué)成分。之后利用TCMSP進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)并篩選，得到RAB活性成分靶點(diǎn)主要包括前列腺素G/H合酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、核受體輔激活劑2(Nuclear receptor coactivator 2，NCOA2)、激素受體(Androgen receptor，AR)、孕激素受體(Progesterone receptor，PGR)和5亞基鈉通道蛋白(Sodium channel protein type 5 subunit alpha，SCN5A)等254個(gè)。

2.2 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在Gene Cards等數(shù)據(jù)庫(kù)得到OB的相關(guān)基因92 370個(gè)，經(jīng)在線Venn圖處理得到RAB靶點(diǎn)與影響OB的靶點(diǎn)的共有基因204個(gè)，即為RAB影響OB的潛在作用靶點(diǎn)。Venn圖見(jiàn)圖1。將虛擬選出的候選化合物和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)得到的靶點(diǎn)基因輸入Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)-細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，得到圖2。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)原理根據(jù)度值由大到小對(duì)篩選出的化合物進(jìn)行分析，詳細(xì)的信息見(jiàn)表1。

圖1 潛在作用靶點(diǎn)Venn圖

注：該網(wǎng)絡(luò)包括220個(gè)節(jié)點(diǎn)，602條邊，其中204個(gè)節(jié)點(diǎn)為RAB作用于OB的靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)中表示為黃色，14個(gè)節(jié)點(diǎn)為RAB作用于OB有直接作用關(guān)系的活性成分，在網(wǎng)絡(luò)中表示為藍(lán)色，紅色菱形表示為藥物和疾病。

表1 RAB影響OB的主要化合物

2.3 RAB影響OB的關(guān)鍵靶點(diǎn)

將上面所得的204個(gè)潛在可能靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)，將上述條件刪選之后得到結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。由于潛在靶點(diǎn)數(shù)目過(guò)多，根據(jù)度值大小選擇度值大于10的前52個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到RAB影響OB關(guān)鍵蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。其中轉(zhuǎn)錄因子AP(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、腫瘤蛋白p53(TP53)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、腫瘤壞死因子(TNF)、RAC-alpha serine/threonine-protein kinase(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、原癌基因c-Fos(FOS)和原癌基因蛋白(MYC)是排名前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)。度值越大表明蛋白質(zhì)在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的影響程度越大，參與的生物功能越多，這也可能是RAB影響OB的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

注：該網(wǎng)絡(luò)包括159個(gè)節(jié)點(diǎn)，692條邊，圓圈由大變小，顏色由深變淺，度值相應(yīng)由大變小，邊的粗細(xì)表示連接評(píng)分，鏈接評(píng)分越高，邊越粗。

注：該網(wǎng)絡(luò)包括52個(gè)節(jié)點(diǎn)，318條邊，圓圈由大變小，顏色由深變淺，度值相應(yīng)由大變小，邊的粗細(xì)表示連接評(píng)分，鏈接評(píng)分越高，邊越粗。

2.4 基因富集分析結(jié)果

將上述潛在靶蛋白上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行GO注釋及KEGG信號(hào)通路的富集分析。其中得到生物過(guò)程(Biology Process，BP)條目616個(gè)，根據(jù)P值大小排名前10的分別是DNA模板轉(zhuǎn)錄(transcription,DNA-templated)、信號(hào)傳導(dǎo)(signal transduction)、藥物反應(yīng)(response to drug)、DNA模板化轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(positive regulation of transcription,DNA-templated)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、基因表達(dá)的正調(diào)控(positive regulation of gene expression)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控(positive regulation of cell proliferation)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)和凋亡過(guò)程(apoptotic process)。細(xì)胞組成(cellular component，CC)條目71個(gè)，根據(jù)P值大小排名前10的分別是質(zhì)膜(plasma membrane)、細(xì)胞核(nucleus)、核質(zhì)(nucleoplasm)、線粒體(mitochondrion)、膜(membrane)、細(xì)胞外空隙(extracellular space)、胞外區(qū)(extracellular region)、胞外體(extracellular exosome)、胞液(cytosol)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)。分子功能(Molecular Function，MF)條目分別為130個(gè)，根據(jù)P值大小排名前10的分別是鋅離子結(jié)合(zinc ion binding)、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity, sequence-specific DNA binding)、序列特異性DNA結(jié)合蛋白(sequence-specific DNA binding)、蛋白質(zhì)同源二聚化活性(protein homodimerization activity)、蛋白質(zhì)異構(gòu)化活性(protein heterodimerization activity)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、同蛋白結(jié)合(identical protein binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)、DNA結(jié)合(DNA binding)和ATP結(jié)合(ATP binding)。KEGG通路分析得到129個(gè)代謝通路，根據(jù)P值大小排名前10的分別是腫瘤壞死因子信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、癌癥中的蛋白聚糖(Proteoglycans in cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥的通路(Pathways in cancer)、小分子核糖核酸在癌癥通路(MicroRNAs in cancer)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、甲型流感(Influenza A)、HTLV-Ⅰ感染(HTLV-Ⅰ infection)乙型肝炎(Hepatitis B)等通路。每個(gè)模塊的前10位條目見(jiàn)圖5，KEGG通路的詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

表2 KEGG通路分析結(jié)果

注：圖A表示BP功能富集分析結(jié)果，圖B 表示CC功能富集分析結(jié)果，圖C表示MF功能富集分析結(jié)果，圖D KEGG通路分析結(jié)果。其中氣泡的大小代表與OB相關(guān)性以及涉及到該通路的基因數(shù)，顏色代表的富集顯著性。

2.5 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D

整合RAB化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)以及上述可能參與到影響OB調(diào)節(jié)過(guò)程的前10條KEGG信號(hào)通路等信息，利用Cytoscape軟件構(gòu)建“化學(xué)成分-OB-KEGG 信號(hào)通路”多維網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖6。

注:該網(wǎng)絡(luò)包括72個(gè)節(jié)點(diǎn)，308條邊，其中紅色菱形表示RAB當(dāng)中主要化學(xué)成分，黃色倒三角表示KEGG通路信息，綠色圓圈表示影響OB關(guān)鍵靶點(diǎn)。

3 討論

OP是由于多種原因?qū)е碌墓敲芏群凸琴|(zhì)量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加，從而容易發(fā)生骨折的全身性骨病,在老年人群中的發(fā)病率較高[13]。OB由于其特性，被認(rèn)為是治療OP的一個(gè)突破口。本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)RAB影響OB的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，構(gòu)建了RAB化學(xué)成分-OB-KEGG 信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)性揭示了RAB影響OB的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。其中槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、β-谷甾醇、黃芩素5個(gè)化合物在網(wǎng)絡(luò)中的度值較大，可能是影響OB的關(guān)鍵化合物。但是不容忽視的是槲皮素、山柰酚兩種化合物在中草藥中分布較廣，這可能不是RAB具有強(qiáng)筋骨特性的關(guān)鍵物質(zhì)。并且由于目前對(duì)于RAB當(dāng)中的β-蛻皮甾酮的研究比較少，所以導(dǎo)致其靶蛋白靶基因的數(shù)據(jù)相對(duì)較少，因而在網(wǎng)絡(luò)中沒(méi)有顯示出來(lái)。并且，姜濤等人通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)β-蛻皮甾酮能夠顯著促進(jìn)OB的增殖以及分化，牛膝甾酮能夠通過(guò)上調(diào)OB分化相關(guān)基因及刺激自噬體的形成而促進(jìn)其的分化[14-15]。這說(shuō)明β-蛻皮甾酮和牛膝甾酮也可能是RAB治療OP的主要活性成分之一。

MAPK是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者[16]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)-MAPK是連接細(xì)胞表面和細(xì)胞核以控制細(xì)胞增殖和分化的重要途徑[17]。既往研究顯示MAPK對(duì)OB的增殖、凋亡及分化有著重要的作用[18-21]。MAPK的激活被證明可以刺激跨基因動(dòng)物OB的分化，并在不影響細(xì)胞增殖的情況下加速發(fā)育胚胎的骨積累[22]。相反，主導(dǎo)陰性MAPK抑制會(huì)減緩細(xì)胞培養(yǎng)中OB的分化，延緩骨發(fā)育[23]。在本研究中，RAB可能通過(guò)MAPK的三種亞型MAPK1、MAPK8、MAPK14來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)OB增值分化的目的，并且這一影響很可能是通過(guò)MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。MAPK信號(hào)通路是經(jīng)典信號(hào)通路之一，有三級(jí)的信號(hào)傳遞過(guò)程：MAPK、MAPK激酶(MEK或MKK)以及MAPK激酶的激酶(MEKK或MKKK)。這三種激酶能依次激活，共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種重要的生理、病理效應(yīng)[24]。大量的研究證明，MAPK信號(hào)通路對(duì)于OB和破骨細(xì)胞的平衡有很大的影響[25]。

TNF是由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷和抑制作用，同時(shí)還有抗感染的作用[26]。TNF細(xì)胞被認(rèn)為是p38的誘導(dǎo)性因子，與MSCs和MC3T3中IL6的合成有關(guān)[27]。研究表明TNF小鼠通過(guò)p38抑制BMP2成骨[28]。化學(xué)抑制p38可恢復(fù)由BMP-2觸發(fā)的RUNX2和其他成骨標(biāo)志物的表達(dá)水平[28]。TNF介導(dǎo)的p38激活也與Rankl的早期表達(dá)有關(guān)，但與晚期表達(dá)無(wú)關(guān)[29]。宋獻(xiàn)美等人研究表明RAB通過(guò)逆轉(zhuǎn) TH17/Treg的失衡、可以抑制TNF的分泌[30]。因而RAB可能通過(guò)抑制TNF的分泌來(lái)影響p38從而改變OB的增值分化，這可能是RAB影響OB的分子機(jī)制之一。腫瘤壞死因子信號(hào)通路在這當(dāng)中的作用也有待于被挖掘。

綜上所述，RAB影響OB具有多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的特點(diǎn)，其主要通路不僅直接參與骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡，調(diào)節(jié)成骨、破骨代謝平衡，還通過(guò)調(diào)節(jié)免疫、炎癥、自噬等干預(yù)OB的功能，影響骨微環(huán)境。但本研究只是在分子機(jī)制上進(jìn)行的預(yù)測(cè)探討，具體藥物作用機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。