吉林省西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺和苯醚甲環唑敏感基線的建立和抗性監測

孫東晗 陳悅 田文學 白慶榮 趙廷昌

摘要 ：為明確吉林省西瓜蔓枯病菌Stagonosporopsis citrulli對咪鮮胺和苯醚甲環唑的抗藥性水平，本試驗采用菌絲生長速率法測定了151株西瓜蔓枯病菌對這兩種藥劑的敏感性及兩種藥劑對西瓜蔓枯病菌的MIC值，并測定了吉林省7個西瓜主產區的375株菌株對這兩種藥劑的抗性水平。結果表明，供試的151株菌株對這兩種藥劑的敏感性頻率分布均呈連續的單峰曲線，接近正態分布;對咪鮮胺和苯醚甲環唑的敏感基線分別為（0.203 0±0.135 3）μg/mL和（0.675 9±0.394 2）μg/mL;兩種藥劑的最低抑制濃度MIC分別為20 μg/mL和40 μg/mL。供試375株菌株對兩種殺菌劑的抗性頻率均為0。本研究結果為咪鮮胺和苯醚甲環唑的合理用藥策略提供了科學依據，為后續其抗性風險評估奠定了基礎。

關鍵詞 ：西瓜蔓枯病菌; 抗藥性; 咪鮮胺; 苯醚甲環唑

中圖分類號：

S 482.2

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020494

Establishment of baseline sensitivity and monitoring of resistance

of Stagonosporopsis citrulli on watermelon to prochloraz

and difenoconazole in Jilin province

SUN Donghan1， CHEN Yue1， TIAN Wenxue2， BAI Qingrong1*， ZHAO Tingchang3*

（1.College of Plant Protection， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2.Shandong

Sino-Agri United Biotechnology Co.，Ltd.， Jinan 250100， China; 3.Institute of Plant

Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

To evaluate the resistance levels of Stagonosporopsis citrulli causing gummy stem blight of Citrullus lanatus in Jinlin province to prochloraz and difenoconazole， the baseline sensitivities of S.citrulli strains （n=151） to the two fungicides and the minimum inhibitory concentrations （MICs） of the two fungicides to S.citrulli strains were determined by using mycelial growth rate method.The resistance levels of 375 stains from seven main watermelon production areas of Jinlin province to two fungicides were also determined.The results showed that the sensitivity frequency distribution of tested strains（n=151） to prochloraz and difenoconazole presented continuous single peak curves， which were close to normal distribution.The baseline sensitivities of S.citrulli strains to prochloraz and difenoconazole were （0.203 0±0.135 3）μg/mL and （0.675 9±0.394 2）μg/mL， respectively.The MICs of prochloraz and difenoconazole were 20 μg/mL and 40 μg/mL， respectively.The resistance frequencies of 375 tested strains to the two fungicides were both zero.The results provided a scientific basis for rational application of prochloraz and difenoconazole， and laid a foundation for the subsequent study on the resistance risk assessment.

Key words

Stagonosporopsis citrulli; fungicide resistance; prochloraz; difenoconazole

西瓜蔓枯病主要是由Stagonosporopsis citrulli引起的世界性病害，在西瓜整個生育期均可發病，危害西瓜葉片、莖稈、藤蔓和果實[12]。在適宜的溫度和濕度條件下，可迅速發展蔓延，大田種植時發病率可達20%～40%，溫室種植和連作時更可達80%，如管理不當常常會造成毀滅性的損失，嚴重影響西瓜的品質和產量[34]。目前關于西瓜蔓枯病的防治措施仍是以化學防治為主，咪鮮胺和苯醚甲環唑對該病害具有見效快，防治效率高等優勢，備受瓜農青睞[56]。2019年對吉林省西瓜蔓枯病菌的優勢種Stagonosporopsis citrulli進行了室內藥劑敏感性的測定，試驗結果表明病菌對咪鮮胺和苯醚甲環唑表現出了較高的敏感性。

自2005年首次報道水稻惡苗病菌對咪鮮胺出現抗性菌株，且抗性頻率為1.46%[7]，至今一些地區因不科學地使用咪鮮胺，使得水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae [8]、菜心炭疽病菌Colletotrichum higginsianum [9]、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum [10]和玉米小斑病菌Bipolaris maydis [11]等已對其產生抗藥性，但其中未有西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺抗藥性方面的相關報道。劉順濤等對重慶、貴州地區西瓜蔓枯病菌對苯醚甲環唑的抗性研究結果表明，該地區仍以敏感菌株為主，但在重慶武隆和貴州息烽發現6株抗性菌株，抗性頻率為2.88%[12]。

咪鮮胺和苯醚甲環唑目前廣泛用于吉林省西瓜蔓枯病的防治，且用藥量較大，因此本研究對吉林省西瓜蔓枯病菌優勢菌株對咪鮮胺和苯醚甲環唑抗藥性進行監測，為制定合理的用藥策略提供科學依據，也為后續研究西瓜蔓枯病菌對上述兩種藥劑的抗性風險評估奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

2018年-2019年連續兩年，在吉林省農安縣、乾安縣、長嶺縣、通榆縣、洮南市、梨樹縣和雙遼市7個西瓜主產區采集具有西瓜蔓枯病癥狀的樣本，通過組織分離法共獲得526株菌株，經三重PCR鑒定確認為西瓜蔓枯病菌優勢種S.citrulli。從中隨機挑選151株用于敏感基線的建立以及MIC值的確定，其余375株用于抗藥性監測。

1.1.2 供試藥劑

98%咪鮮胺原藥（江蘇輝豐股份有限公司）和96%苯醚甲環唑原藥（山東省聯合農藥工業有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 含藥培養基的配制

將供試藥劑均溶于丙酮，配制成1×104μg/mL的母液，于4℃冰箱貯存，備用[13]。

將母液用無菌水以10倍為梯度，依次稀釋成1×103、1×102、1×101、1、1×10-1μg/mL的藥液。再將PDA培養基與制好的藥液按體積比9∶1混合均勻制成不同濃度的含藥平板。

1.2.2 西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺和苯醚甲環唑的敏感性測定

將供試菌株在PDA平板上培養4 d后，用滅菌的移液槍槍頭在菌落邊緣打取8 mm的菌餅移至含藥濃度分別為1×102、1×101、1、1×10-1、1×10-2μg/mL的PDA培養基中央，每個濃度處理重復3次，以加等量無菌水的正常PDA培養基作為空白對照，在25℃恒溫、全光照、30% RH條件下培養至對照菌落直徑為培養皿直徑的2/3時，采用十字交叉法測量菌落直徑。

利用VBA軟件計算出藥劑對病原菌的毒力回歸方程y=a+bx，相關系數（r）以及有效抑制中濃度（EC 50）值。

用SPSS軟件繪制西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺和苯醚甲環唑的敏感性頻率分布圖，根據野生敏感型病原群體對藥劑敏感性為正態分布的原理，確認病原菌群體EC 50敏感性頻率分布是否呈正態分布或連續的單峰曲線，如果呈正態分布或連續的單峰曲線，就可將其群體EC 50均值作為病原菌對藥劑的敏感基線[14]。

1.2.3 咪鮮胺和苯醚甲環唑對西瓜蔓枯病菌MIC值的確定及抗性監測

將1.2.2中測定過EC 50的151株敏感菌株按相同方法制成8 mm菌餅，移至含咪鮮胺和苯醚甲環唑濃度均為10、20、30、40、50 μg/mL的PDA培養基中央，于25℃恒溫，全光照，30%RH培養，每個濃度處理均設3次重復。培養4 d后，觀察菌絲生長情況，將所有菌株均不能生長的最低濃度確認為咪鮮胺和苯醚甲環唑對西瓜蔓枯病菌敏感菌株的最低抑制濃度即MIC（minimal inhibition concentration）。

將2018年-2019年采自吉林省7個縣市的375株西瓜蔓枯病菌菌株活化培養后，按1.2.2中方法制成菌餅分別移至含最低抑制濃度20 μg/mL咪鮮胺和40 μg/mL苯醚甲環唑的PDA培養基上，以含等量無菌水的PDA培養基作為空白對照，均設3次重復，在25℃恒溫，全光照，30%RH條件下培養4 d后，觀察菌絲生長情況劃分抗性類型，并計算其抗性頻率。

抗性頻率=（抗性菌株數/總菌株數）×100%。

2 結果與分析

2.1 吉林省西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺的敏感基線及抗性監測

2.1.1 西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺的敏感基線

咪鮮胺對吉林省西瓜主產區西瓜蔓枯病菌S.citrulli的EC 50范圍為0.059 3～0.590 7 μg/mL（表1）。不同地點的EC 50范圍：松原市乾安縣0.086 9～0.578 4 μg/mL，長嶺縣0.077 0～0.590 7 μg/mL;白城市洮南市0.064 7～0.535 8 μg/mL，通榆縣0.066 9～0.543 4 μg/mL;四平市雙遼市0.059 3～0.503 5 μg/mL，梨樹縣0.079 3～0.536 6 μg/mL;長春市農安縣0.072 0～0.469 0 μg/mL。咪鮮胺對7個縣市西瓜蔓枯病菌的EC 50沒有顯著性差異，其中EC 50最小值為0.059 3 μg/mL，最大值為0.590 7 μg/mL，相差9.96倍。

根據測定的151株菌株對咪鮮胺的敏感性，繪制西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺的敏感性分布圖（圖1）。其平均值為（0.203 0±0.135 3）μg/mL。供試的151株西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺的敏感性頻率分布呈近似正態的單峰曲線，因此可將其EC 50平均值作為吉林省西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺的敏感基線。

2.1.2 咪鮮胺對西瓜蔓枯病菌MIC值的確定及抗性監測

通過菌絲生長速率法測定咪鮮胺對供試151株菌株的MIC值，確定其范圍在10～20 μg/mL之間。結合其敏感基線以及測得的MIC值，將20 μg/mL作為區分吉林省西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺的抗性或敏感的濃度，即不能在含20 μg/mL咪鮮胺的PDA平板上生長的為敏感菌株。測定2018年-2019年采自吉林省的375株西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺均敏感，未監測到抗藥性菌株，抗性頻率為0（表2）。

2.2 吉林省西瓜蔓枯病菌對苯醚甲環唑的敏感基線及抗性水平

2.2.1 西瓜蔓枯病菌對苯醚甲環唑的敏感基線

苯醚甲環唑對吉林省西瓜蔓枯病菌的EC 50范圍為0.162 2～1.563 0 μg/mL。如表3所示，按地區劃分其EC 50分別為：松原市乾安縣0.392 8～1.376 5 μg/mL，長嶺縣0.209 6～1.478 5 μg/mL;白城市洮南市0.230 4～1.465 1 μg/mL，

通榆縣0.163 7～1.465 2 μg/mL;四平市雙遼市0.173 9～1.563 0 μg/mL，梨樹縣0.287 8～1.497 6 μg/mL;長春市農安縣0.162 2～1.325 8 μg/mL。苯醚甲環唑對7個縣市西瓜蔓枯病菌的EC 50沒有顯著性差異，其中EC 50最小值為0.162 2 μg/mL，最大值為1.563 0 μg/mL，相差9.64倍。

根據測定的151株供試菌株對苯醚甲環唑的敏感性，繪制西瓜蔓枯病菌對苯醚甲環唑的敏感性頻率分布圖（圖2），其平均值為（0.675 9±0.394 2）μg/mL。供試的151株西瓜蔓枯病菌對苯醚甲環唑的敏感性頻率分布呈近似正態的單峰曲線，因此可將其EC 50平均值作為吉林省西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺的敏感基線。

2.2.2 苯醚甲環唑對西瓜蔓枯病菌MIC值的確定及抗性監測

通過菌絲生長速率法測定苯醚甲環唑對供試151個菌株的MIC值在30～40 μg/mL之間，再結合其敏感基線，將40 μg/mL作為區分吉林省西瓜蔓枯病菌對苯醚甲環唑的抗性或敏感的濃度，即不能在含40 μg/mL苯醚甲環唑的PDA平板上生長的為敏感菌株。2018年-2019年采自吉林省的375株西瓜蔓枯病菌對苯醚甲環唑均敏感，未監測到田間抗性菌株，田間抗性頻率為0（表4）。

3 結論與討論

西瓜蔓枯病是西瓜生產上的重要病害之一，目前仍以化學防治為主。近年來，咪鮮胺與苯醚甲環唑廣泛用于吉林省西瓜主產區西瓜蔓枯病的防治。及時了解西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺和苯醚甲環唑的抗藥性對藥劑的合理使用尤為重要。本試驗測定了吉林省7個西瓜主產區中151株西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺和苯醚甲環唑的敏感性。咪鮮胺對西瓜蔓枯病菌的EC 50為0.059 3～0.590 7 μg/mL，苯醚甲環唑對西瓜蔓枯病菌的EC 50為0.162 2～1.563 0 μg/mL，雖然不同菌株之間存在敏感性差異，但EC 50范圍相對較窄，且最大值與最小值相差倍數分別為9.96和9.64，說明這兩種殺菌劑對西瓜蔓枯病菌具有很高的抑制活性。

所測定的151株西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺和苯醚甲環唑的敏感性頻率均呈近似正態分布的單峰曲線，病菌對咪鮮胺的敏感基線為（0.203 0±0.135 3）μg/mL，對苯醚甲環唑的敏感基線為（0.675 9±0.394 2）μg/mL。咪鮮胺和苯醚甲環唑對151株西瓜蔓枯病菌的MIC值分別為10～20 μg/mL及30～40 μg/mL，結合相應敏感基線，確定20 μg/mL和40 μg/mL分別作為吉林省西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺和苯醚甲環唑的抗性監測標準濃度。監測了吉林省西瓜主產區375株西瓜蔓枯病菌對兩種藥劑的抗藥性，均未發現抗藥性菌株，抗性頻率為0。

劉順濤等報道重慶武隆、貴州息烽出現少量對苯醚甲環唑敏感性下降的亞群體，表現為低抗和中抗[12]。目前吉林省內尚未發現對苯醚甲環唑產生抗藥性的西瓜蔓枯病菌菌株，可能與藥劑使用年限較短，用藥水平不高有關。祁之秋等報道脫甲基抑制劑（咪鮮胺）抗性發展緩慢，但長期使用也會出現抗藥性[15]。因此，應加強定期抗性監測工作，及時了解病原菌敏感性變化動態，科學應用咪鮮胺和苯醚甲環唑，以延緩病原菌對其產生抗藥性，從而延長咪鮮胺和苯醚甲環唑的使用年限且保證高效性。

通過對吉林省西瓜蔓枯病菌的抗藥性監測來掌握該病原菌對咪鮮胺和苯醚甲環唑敏感性的基礎數據及抗藥性，也為西瓜蔓枯病菌對咪鮮胺和苯醚甲環唑的抗藥性風險評估奠定基礎。

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（責任編輯：田 喆）