蛇蟻噴霧劑的制備及質量控制研究

葉炳皇，陳澤偉

(1.中山市黃圃人民醫院，廣東 中山；2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州)

0 引言

“蟻蛇方”借鑒于古代醫家孫思邈《千金方》中治療“痹癥”的經典藥酒方劑，通過加減藥味，形成獨特配方，共奏祛風濕、通經絡、止痹痛之功，以補肝腎、強筋骨、祛風寒濕、行氣活血之法以達通絡止痛的目的，主治風寒濕阻所致腰痛、頸椎病、肩關節周圍炎、關節炎、關節扭傷等諸多痹證，以酒劑形式長期應用于臨床，近十年、上千個病例證明，療效確切、安全可靠。但發現“蟻蛇方”藥酒在臨床應用時，存在品相不憂、穩定性不佳、使用不方便等劑型缺陷，故我院與廣州中醫藥大學新藥中心攜手合作，克服“傳統酒劑向新型噴霧劑轉換”的劑型創新瓶頸，將其開發成專科局部外用噴霧劑，并對其制備工藝、質量標準進行了研討，以便進一步有效控制產品質量，保證臨床療效[1]。

1 儀器與試藥

Water e2695 高效液相色譜儀、2998檢測器，美國沃特世科技公司；電子天平(萬分之一/十萬分之一)，日本島津AUW220D；WFH-203三用紫外分析儀，上海精科實業有限公司。

芍藥苷(批號110753-201539)、丹參酚酸B(批號111562-201514)、鹽 酸 巴 馬 汀 (批 號 1107322-201510)，丁香對照藥材(批號121039-201405)、丹參對照藥材(批號120923-201113)，赤芍對照藥材(批號121093-201303)均來自中國食品藥品檢定研究院。水為超純水，甲醇為色譜純，德國默克公司；其余試劑均為分析純。蛇蟻噴霧劑(批號20190301、20190302、20190303)；赤芍陰性對照樣品、當歸陰性對照樣品、丹參陰性對照樣品、丁香陰性對照樣品、黃藤陰性對照樣品均由中山市黃圃人民醫院自制。

2 制備工藝

按處方比例稱取烏梢蛇20g，黑螞蟻20g，羌活8g，獨活8g，威靈仙 8g，黃藤 12g，丹參 16g，赤芍 12g，當歸 8g，雞血藤8g，丁香8g等十八味共96 g，粉碎成粗粉，2倍量70%乙醇使潤濕，浸漬24小時后，用70%乙醇作為溶劑，以9mL/min·Kg的漉速進行滲漉，收集初漉液約2倍量，另器保存。繼續滲漉至藥材量的12倍量為止，收集續漉液，回收乙醇，減壓濃縮至約1.0g生藥/mL，濾過，濾液與初漉液合并，加入甘油90g、羥苯乙酯1g，攪拌混勻，調節乙醇量至40%～50%，靜置，濾過，加50%乙醇至1000mL，分裝，即得。

3 質量控制

3.1 性狀

本品為棕黃色至棕褐色液體；氣微腥。

3.2 檢查

本 品 的 相 對 密 度 為 0.88～0.98(通 則 0601)；pH 值 為4.5～6.0(通則 0631)；乙醇量為 40%～50%(通則 0711)；微生物限度檢查，需氧菌總數計每1mL不得過102cfu 、霉菌及酵母菌計數每1mL不得過101cfu 、每1mL不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌；其它應符合非定量噴霧劑項下有關的各項規定(通則0112)。

3.3 定性鑒別

3.3.1 丁香薄層鑒別

取本品50mL，減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至30mL，石油醚(60～90℃)振搖提取3次，每次20mL，水液備用，合并石油醚液，揮干，殘渣加無水乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液；另取丁香對照藥材0.5g，加乙醚5mL，振搖數分鐘，濾過，濾液作為對照藥材溶液。再取丁香陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》通則0502)試驗，吸取上述三種溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(9:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，呈相同顏色的斑點，陰性對照相同位置無干擾，結果見圖1。

3.3.2 黃藤薄層鑒別

取[丁香鑒別]項下的水液用濃氨水調pH值11～12，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次30mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加甲醇20mL使溶解，加中性氧化鋁柱(100～200目，6g，1.0cm)上，收集過柱液，作為供試品溶液；另取鹽酸巴馬汀對照品，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。再取黃藤陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》通則0502)試驗，吸取上述三種溶液各4μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-濃氨試液(6:3:1.5:1.5:0.5)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內預飽和10分鐘，展開，取出，晾干，置紫外燈下(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，呈相同顏色的斑點，陰性對照相同位置無干擾，結果見圖2。

圖2黃藤薄層鑒別色譜圖

3.3.3 赤芍薄層鑒別取本品50mL，減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至30mL，石油醚(60～90℃)振搖提取3次，每次20mL，合并石油醚液備用，水液用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次30mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌6～8次，每次50mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇15mL使溶解，加中性氧化鋁柱(100～200目，6g，1.0cm)上，收集過柱液，蒸干，殘渣加甲醇0.5mL使溶解，作為供試品溶液；另取赤芍對照藥材0.5g，加乙醇10mL，振搖5分鐘，濾過，蒸干濾液，殘渣加乙醇2mL使溶解，作為對照藥材溶液。另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。再取赤芍陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》通則0502)試驗，吸取上述四種溶液各4μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-濃氨試液(4:1:0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，在日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，呈相同顏色的斑點，陰性對照相同位置無干擾，結果見圖3。

圖3赤芍薄層鑒別色譜圖

3.3.4 丹參薄層鑒別取[赤芍鑒別]項下石油醚液，揮干，殘渣加乙酸乙酯0.5mL使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1g，加乙醇5mL，超聲15分鐘，離心，取上清液作為對照藥材溶液。再取丹參陰性樣品，按供試品溶液制備方法同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》通則0502)試驗，吸取上述三種溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(5:1)為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，呈相同顏色的斑點，陰性對照相同位置無干擾，結果見圖4。

圖4 丹參薄層鑒別色譜圖

3.4 含量測定

3.4.1 色譜條件

圖5 芍藥苷專屬性HPLC圖譜

圖6 阿魏酸、丹參酚酸B 專屬性HPLC圖譜

Kromasil C18色譜柱 (4.6mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液進行梯度洗脫(0～20min，30%～37%A；20～25min，37%～45% A；25～35 min，45%～45% A；35～40 min，45%～60% A；40～45 min，60%～30% A；45～55 min，30%～30%A)；流速：1.0 mL·min-1；芍藥苷檢測波長 230nm，阿魏酸、丹酚酸B檢測波長286nm；柱溫30℃。在此條件下，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，陰性對照未見干擾。結果見圖5、圖6。

3.4.2 溶液的制備

3.4.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對照品11.14 mg、丹酚酸B 12.85mg，分別置10mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為芍藥苷對照品貯備液、丹酚酸B對照品貯備液。精密稱取阿魏酸對照品19.04mg，置500mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為阿魏酸對照品貯備液。分別精密量取芍藥苷對照品貯備液、丹酚酸B對照品貯備液、阿魏酸對照品貯備液各5mL，置100mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

3.4.2.2 供試品溶液的制備

精密量取本品5mL，置10mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

3.4.2.3 陰性對照品溶液的制備

取赤芍陰性對照樣品、當歸陰性對照樣品、丹參陰性對照樣品各適量，照“3.4.2.2”項下方法制備赤芍陰性對照溶液、當歸陰性對照溶液、丹參陰性對照溶液。

3.4.3 方法學考察

3.4.3.1 線性關系考察

精密吸取上述混合對照品溶液 2，4，8，10，12，16，20 μL注入色譜儀測定，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，對照品進樣質量(μg)為橫坐標(X)繪制標準曲線，芍藥苷的回歸方程為：Y= 1363527.2587X+ 1，022.1831(r=0.9998)；丹酚酸 B 的回歸方程為Y= 1780692.2782X+ 1157.2113(r=0.9999)；阿魏酸的回歸方程為：Y=5714693.5201X - 1.1667(r=1.0000)。結果表明，芍藥苷在 0.1114～1.1140μg，阿魏酸在 0.0038～0.0381μg，丹酚酸B在0.1285～1.2850 μg，進樣質量與峰面積線性關系良好。

3.4.3.2 穩定性實驗

精密吸取同一份供試品溶液，分別于 0、2、4、8、16、24 h按照3.4.1項下色譜條件進樣測定，分別測得峰面積，芍藥苷平均峰面積的RSD為1.25%、阿魏酸平均峰面積的RSD為1.72%、丹酚酸B平均峰面積的RSD為1.02%，表明樣品在24 h內穩定，未見明顯變化。

表1 加樣回收率結果

續表1

表2 樣品測定結果

3.4.3.3 重復性實驗

精密量取芍藥苷對照品貯備液、丹酚酸B對照品貯備液、阿魏酸對照品貯備液各5mL，置50mL量瓶中，加甲醇依法處理制得混合對照品溶液，重復操作6次，按照3.4.1項下色譜條件進行試驗，分別進樣10μL，測定峰面積，以芍藥苷、阿魏酸及丹酚酸B的含量計算， RSD分別為0.66%(n=6)、0.43%(n=6)、0.20%(n=6)，表明該方法重復性良好。

3.4.3.4 加樣回收試驗

精密量取已知含量的同一批供試品原液5.0mL，共9份，置于10mL量瓶中，分別精密加入芍藥苷濃度為0.5570mg·mL-1、阿魏酸濃度為 0.0190mg·mL-1、丹酚酸 B 濃度為 0.6430 mg·mL-1的混合對照品溶液 0.5，1.0，1.5 mL，按照3.4.1項下色譜條件，進樣10μL，測定峰面積，計算回收率。芍藥苷平均回收率為99.7%，RSD為0.61%；阿魏酸平均回收率為100.4%，RSD為0.77 %；丹酚酸B平均回收率為100.4%，RSD為0.60 %。結果表明，本方法回收率良好，符合定量分析要求。

3.4.4 樣品測定

取三批樣品，按照“3.4.2.2”項下方法制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按照“3.4.1”項下色譜條件測定，結果見表2。

4 討論

4.1 工藝的合理性探討

本組方的中試研究顯示，其滲漉工藝產物中芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B的保留率分別為90%、80%、60%，其中初漉液中芍藥苷、丹酚酸B保留率分別為50%、35%、25%，提示該組方有效物質基礎保留四分之一到二分之一，故將初漉液另器存儲，不經過濃縮步驟，直接用于噴霧劑的配液。而中試濃縮結果顯示，續漉液經大生產條件下濃縮后，芍藥苷相對保留90%，而丹酚酸B相對保留只有65%，表明大生產條件下，復方中不穩定成分明顯減損，與文獻報道一致[2]。綜上所述，本品的制備工藝“收集2倍量初漉液，另器保存”，有效地減少了熱不穩定成分的損失，使得成品的指標成分保留率與臨床方劑近似[3]，從而確保有效物質基礎不變，提示該關鍵工藝步驟合理可行，值得業內推崇。

4.2 薄層鑒別供試品制備方法及展開劑毒性的探討

基于該組方含十八味藥材，薄層鑒別的復方背景比較復雜，容易出現陰性干擾、重現性不佳的問題，故本文尤其關注供試品溶液的純化分離。如赤芍鑒別項下供試品溶液的制備，本文曾考察了三種供試品制備方法。方法1：取石油醚振搖提取后的水液，乙酸乙酯振搖提，棄去乙酸乙酯液，水液用水飽和正丁醇振搖提取，提取液氨洗，蒸干，加甲醇使溶解，作為供試品溶液。方法2：取石油醚振搖提取后的水液，水飽和正丁醇振搖提取，提取液蒸干，甲醇使溶解上中性氧化鋁柱，過柱液蒸干，加甲醇使溶解，作為供試品溶液。方法3：取石油醚振搖提取后的水液，水飽和正丁醇振搖提取，提取液氨洗，蒸干，加甲醇使溶解，上中性氧化鋁柱，過柱液加甲醇使溶解，作為供試品溶液。結果表明，采用方法3處理的供試品色譜，展開效果較理想，特征斑點清晰、分離度高。

另外，關于展開劑含有三氯甲烷的問題，文獻報道及2015版《中國藥典》成方制劑收載丹參[4-5]、赤芍[6-9]藥材的鑒別項下展開劑均含三氯甲烷，為了實現勞動保護[10]，本文經摸索，結果表明赤芍、丹參可采用不含三氯甲烷的展開劑進行鑒別，特征斑點清晰、專屬性好、重現性較佳，值得參考。