基于ITS2序列的海桐皮及其混偽品DNA分子鑒定

田 榮，吳 云，谷 巍，單鳴秋，谷宇琛，馬麗杰，裴凌峰

? 藥材與資源 ?

基于ITS2序列的海桐皮及其混偽品DNA分子鑒定

田 榮1，吳 云2#，谷 巍1*，單鳴秋1，谷宇琛1，馬麗杰1，裴凌峰1

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

應(yīng)用ITS2條形碼技術(shù)，對(duì)海桐皮及其混偽品進(jìn)行分子鑒定。通過(guò)提取31份海桐皮藥材基原植物刺桐、喬木刺桐及其混偽品的基因組DNA，擴(kuò)增ITS2序列并測(cè)序；同時(shí)從GenBank下載混偽品序列15種38條，運(yùn)用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，進(jìn)行種間序列差異分析比較，并構(gòu)建Neighbor-jioning（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，預(yù)測(cè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)。在海桐皮2種基原中，刺桐的ITS2序列長(zhǎng)度為232 bp，喬木刺桐的ITS2序列長(zhǎng)度為230 bp，均為單倍型，可以明顯區(qū)分；同時(shí)與其他刺桐屬及易混品之間遺傳距離較遠(yuǎn)。NJ樹(shù)結(jié)果顯示刺桐、喬木刺桐及其他易混品均單獨(dú)聚為一支，表現(xiàn)出良好的單系性；依據(jù)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，刺桐、喬木刺桐及其混偽品在4個(gè)螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)目、大小、位置以及螺旋發(fā)出時(shí)的角度均有明顯差異，可以直觀地將刺桐與喬木刺桐，以及其與易混品進(jìn)行區(qū)分。ITS2序列作為DNA條形碼能穩(wěn)定、準(zhǔn)確鑒別海桐皮藥材，為保障安全用藥提供了新的技術(shù)手段。

海桐皮；刺桐；喬木刺桐；易混品；ITS2；物種鑒定

海桐皮為豆科植物刺桐L. var.(L.) Merr. 或喬木刺桐Roxb. 的干燥樹(shù)皮。其味苦、辛，性平，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、殺蟲(chóng)等功效。主治風(fēng)濕痹痛、痢疾、牙痛、疥癬。其也常用作抗菌劑、抗炎劑、退熱劑及防腐劑?[1]。化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)海桐皮所含主要次生代謝產(chǎn)物為生物堿、黃酮及異黃酮類化合物?[2]，其中黃酮及異黃酮類化合物有抗菌、抗炎、抑制Na?+/H?+交換系統(tǒng)活性及抑制磷脂酶A2的活性?[3]。海桐皮的提取物還具有抗腫瘤活性，可通過(guò)穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而抑制端粒酶的活性，破壞腫瘤細(xì)胞的永生化，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡?[4]。

本草考證表明海桐皮史載于《開(kāi)寶本草》。《本草圖經(jīng)》云：“海桐皮，出南海以南山谷，今雷州及近海州郡亦有之。葉如手大，作三花尖。皮梓白而堅(jiān)韌，可做繩，入水不爛。”又云：“嶺南有刺桐，葉如梧桐，花側(cè)敷如掌，枝干有刺，花色深紅。”按植物形態(tài)描述及來(lái)源證明與今之海桐皮原植物刺桐相似，且從《本草綱目》《本草推新》《本草備要》的插圖也可以看出其為豆科刺桐屬植物。

海桐皮藥材存在嚴(yán)重同名異物，藥用情況混亂、質(zhì)量不可控的問(wèn)題，且用藥混亂問(wèn)題由來(lái)已久，混用品頗多，且都為不同科屬植物，如五加科植物刺楸(Thunb.) Koidz.的干燥樹(shù)皮（川桐皮），蕓香科植物椿葉花椒（食茱萸）Sieb. et Zucc.和朵椒Rehd. 的干燥樹(shù)皮（浙桐皮）等?[5]。同名藥材來(lái)源的多樣性容易混淆使用并使得臨床療效不確定。由于缺乏專業(yè)的鑒定人員，而從外觀上海桐皮與其他混偽品難以區(qū)分，容易造成混用。因此，亟待建立一種迅速、簡(jiǎn)便有效的鑒定方法來(lái)區(qū)分海桐皮及其易混品以確保海桐皮種質(zhì)、種源，保障臨床安全用藥。

DNA條形碼是當(dāng)前生物分類學(xué)的熱門(mén)技術(shù)，是利用一段有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段（500～1000 bp）對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的自動(dòng)鑒定。作為DNA候選序列的ITS2片段因其具有較強(qiáng)引物通用性、較高測(cè)序成功率以及足夠的序列變異性，而被大家廣泛關(guān)注?[6]。當(dāng)前，國(guó)家藥典委員會(huì)討論通過(guò)在《中國(guó)藥典》增補(bǔ)本中列入中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，該指導(dǎo)原則規(guī)定植物類藥材的DNA條形碼鑒定以ITS2序列為主，其鑒定能力也在藥用植物多個(gè)科屬基原植物及藥材的鑒定中得到了驗(yàn)證?[7-13]。

迄今，海桐皮基原刺桐和喬木刺桐的分子鑒定少見(jiàn)報(bào)道。本研究提取刺桐、喬木刺桐及易混品植物DNA并測(cè)定其ITS2序列進(jìn)行分子鑒定，旨在為海桐皮藥材的快速準(zhǔn)確鑒定及開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和儀器

1.1 材料

2018年4～10月，從福建、廣東、貴州、云南、浙江省收集刺桐、喬木刺桐及其易混品樣品34份，均由南京中醫(yī)藥大學(xué)谷巍教授鑒定為刺桐var.L.、喬木刺桐Roxb.、雞冠刺桐L.、韓氏刺桐Verdc.、翅果刺桐(Hassk.) Merr.、龍牙花L.、蝙蝠刺桐Benth.、絨毛刺桐Willd.、乙狀刺桐Hua.、簕欓花椒(Lam.) DC.、楤木(Miq.) S(L.) Gaertn.、栓翅刺桐eem.、木棉L.、吉貝Roxb.、勁直刺桐Roxb.、塞內(nèi)加爾刺桐DC.、刺楸(Thunb.) Koidz.、椿葉花椒Sied. et. Zucc.、大葉臭花椒Wall. ex Hook. f.、朵花椒Rehd.。其中編號(hào)4～6的刺桐樣品為藥材，其他樣品是采集植物樣品后，按地方標(biāo)準(zhǔn)《四川省中藥炮制規(guī)范》2015年版將樹(shù)皮加工為藥材。憑證樣本和數(shù)字影像信息保于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本館，實(shí)驗(yàn)材料信息及GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表1。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了相關(guān)的ITS2序列共38條，信息見(jiàn)表1。

1.2 儀器與試劑

Sigma 3-18K高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司，德國(guó)）；Compact水平蛋白電泳儀（Biometra公司，德國(guó)）；Bio-Rad C1000PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）；Gel DocXR＋凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，德國(guó)）；DP316植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）、引物由上海捷瑞有限公司合成。

2 方法

2.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

將藥材打粉，過(guò)80目篩，取100 mg樣品，DNA的提取參照植物基因組DNA提取試劑盒操作步驟進(jìn)行（水浴時(shí)間調(diào)整為60 min）。（ITS2）序列擴(kuò)增正向引物5’-ATGCGATACT- TGGTGTGAAT-3’；反向引物5’-GACGC- TTCTCCAGACTACAAT-3’。擴(kuò)增體系（25 μL）為10×PCR buffer（無(wú)MgCl?2）2.5 μL，MgCl?2（25 mmol/L）2 μL，dNTP 2 μL，正、反向引物各1 μL，Taq酶0.25 μL，模板2 μL，雙蒸水14.25 μL。ITS2序列擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。測(cè)序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次測(cè)序。

表1 材料產(chǎn)地及其ITS2序列信息

續(xù)表1

編號(hào)植物名單倍型序列長(zhǎng)度/bpGC/%GenBank登錄號(hào)產(chǎn)地 45木棉M123772.2DQ826447Gen Bank 46吉貝N123068.7KM453169Gen Bank 47 N123068.7HQ658386Gen Bank 48栓翅刺桐O123345.9JX856569Gen Bank 49勁直刺桐P123962.3KR532088Gen Bank 50塞內(nèi)加爾刺桐Q122050.0KX057870Gen Bank 51刺楸R123063.9MN422126江蘇南京 52 R123063.9MN422127江蘇南京 53 R123063.9MN422128江蘇南京 54 R123063.9MN422129遼寧丹東 55 R123063.9MN422130遼寧丹東 56 R123063.9AJ786228Gen Bank 57 R123063.9MG217641Gen Bank 58 R123063.9JQ048757Gen Bank 59 R123063.9JQ048756Gen Bank 60 R123063.9JQ048755Gen Bank 61 R223063.5AY256899Gen Bank 62椿葉花椒T122469.2MN422131浙江舟山 63 T122469.2MN422132浙江舟山 64 T122469.2MN422133浙江舟山 65 T122469.2MN422134福建福州 66 T122469.2MH016477Gen Bank 67 T122469.2MH016478Gen Bank 68大葉臭花椒S122472.8MG730220Gen Bank 69 S122472.8KP093220Gen Bank 70 S122472.8KP093219Gen Bank 71 S122472.8MG730221Gen Bank 72朵花椒U122667.3MF039518Gen Bank

2.2 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序后所得峰圖采用Codon Code AlignerV 2.06（Codon Code Co.，美國(guó)）校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)；使用基于隱馬爾可夫模型的HMM注釋方法?[14]，去除拼接得到的一致序列的兩端5.8 S和28 S區(qū)段?[15]（可將序列提交至http://its2.bioapps. biozentrum.uni-wuerzburg.de進(jìn)行注釋），獲得標(biāo)準(zhǔn)ITS2間隔區(qū)序列。研究采用MEGA5.0軟件[16]比對(duì)所有序列，計(jì)算種內(nèi)序列變異和種間序列變異，不同物種的單倍型為A1、B1，同一物種存在變異位點(diǎn)的單倍型為A1、A2，分析變異位點(diǎn)的信息確定不同的單倍型?[17]，采用相似性搜索法（BLAST1）和最小距離法（nearest distance）?[18]考察ITS2序列的鑒定成功率，構(gòu)建Neighbor-joining（NJ）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)評(píng)估各物種之間的親緣性。根據(jù)Koetschan等?[19]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)及其網(wǎng)站預(yù)測(cè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果與分析

3.1 海桐皮藥材及其易混品藥用植物PCR擴(kuò)增效率及測(cè)序成功率

對(duì)所有實(shí)驗(yàn)樣本的ITS2序列分析發(fā)現(xiàn)，PCR擴(kuò)增及測(cè)序成功率均為100%，序列獲得率（有效序列比例）亦為100%，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳得到PCR擴(kuò)增電泳圖，擴(kuò)增效果較好，條帶較亮，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象。擴(kuò)增序列長(zhǎng)度范圍在450～550 bp（圖1），除去5.8 S和28 S rRNA序列后，ITS2序列長(zhǎng)度范圍在224～238 bp，GC含量為47.0%～69.2%，平均GC含量為52.79%。

M-Marker 1～6-刺桐 7～11-喬木刺桐 12～15-雞冠刺桐 16～18-韓氏刺桐 19～23-翅果刺桐 24～25-龍牙花 26～30-刺揪 31～34-椿葉花椒

M-Marker 1—6-var.7—11-12—15-16—18-19—23-24—25-26—30-31—34-

圖1 樣本的ITS2序列凝膠電泳圖

Fig. 1 Electrophoretogram of ITS2 sequences of samples

3.2 海桐皮藥材與其易混品的ITS2序列差異研究

本實(shí)驗(yàn)中各地采集的刺桐之間無(wú)變異位點(diǎn)，而與其易混品之間存在多個(gè)變異位點(diǎn)。刺桐不同來(lái)源的ITS2序列共6條，序列長(zhǎng)度為232 bp，ITS2序列的GC含量為50.4%，種內(nèi)無(wú)變異位點(diǎn)，為單倍型，種內(nèi)K2P遺傳距離為0；喬木刺桐ITS2序列長(zhǎng)度為230 bp，ITS2序列的GC含量為48.3%，種內(nèi)無(wú)變異位點(diǎn)，為單倍型，種內(nèi)K2P遺傳距離為0；說(shuō)明刺桐及喬木刺桐種內(nèi)ITS2序列高度保守。刺桐、喬木刺桐與海桐皮易混品的K2P距離為0.125 1～0.951 4、0.063 7～0.968 0，海桐皮2種基原種內(nèi)最大遺傳距離均小于其與易混品的種間最小遺傳距離（表2），具有明顯的條形碼間距，說(shuō)明K2P距離可很好地區(qū)分開(kāi)海桐皮藥材及其易混品。實(shí)驗(yàn)樣品中各物種ITS2序列，長(zhǎng)度、GC含量見(jiàn)表1。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的數(shù)據(jù)結(jié)合，在更大樣本量下考察海桐皮藥材及其易混品的變異情況。結(jié)果表明，刺桐及喬木刺桐與其易混品的種間變異差異明顯，ITS2可以將其區(qū)分開(kāi)，刺桐與喬木刺桐差異也較為明顯，可以加之區(qū)分。

表2 ITS2序列的種間差異和種內(nèi)變異分析

3.3 海桐皮藥材與其易混品的ITS2序列變異位點(diǎn)分析

3.3.1 海桐皮藥用植物不同來(lái)源樣品種間變異分析 通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的6份刺桐樣品的ITS2序列分析，發(fā)現(xiàn)其ITS2序列無(wú)變異位點(diǎn)，為單倍型。喬木刺桐種內(nèi)亦無(wú)變異位點(diǎn)，為單倍型；刺桐與喬木刺桐ITS2序列種間存在27個(gè)變異位點(diǎn)，可以明顯區(qū)分。

3.3.2 海桐皮易混品植物種內(nèi)變異分析 對(duì)海桐皮易混品之間進(jìn)行種內(nèi)變異統(tǒng)計(jì)分析，變異位點(diǎn)及單倍型統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。雞冠刺桐種內(nèi)為3個(gè)單倍型，存在2個(gè)變異位點(diǎn)；簕欓花椒種內(nèi)為3個(gè)單倍型，存在2個(gè)變異位點(diǎn)；刺揪種內(nèi)為2個(gè)單倍型，存在1個(gè)變異位點(diǎn)；翅果刺桐存在2個(gè)單倍型，有7個(gè)變異位點(diǎn)；龍牙花種內(nèi)為2個(gè)單倍型，存在2個(gè)變異位點(diǎn)。

3.4 海桐皮藥材及其易混品ITS2序列分析

采用BLAST和最近距離法對(duì)刺桐、喬木刺桐與其易混品進(jìn)行鑒定研究，2種方法分析結(jié)果均表明ITS2序列可以準(zhǔn)確地將海桐皮與其易混品之間鑒別開(kāi)。為了更直觀地反映鑒定結(jié)果，本研究基于相似性搜索法和最近距離法結(jié)果構(gòu)建了NJ系統(tǒng)聚類樹(shù)，bootstrap 1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，刺桐與喬木刺桐分別聚為一支，且互有區(qū)別。同時(shí)，與其他物種之間遺傳距離較遠(yuǎn)，物種之間可以明顯區(qū)分。

表3 海桐皮易混品藥用植物種內(nèi)變異分析

bootstrap 1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%

3.5 海桐皮藥材與其易混品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

根據(jù)Koetschan等[19]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)及其網(wǎng)站預(yù)測(cè)刺桐、喬木刺桐與其易混品的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3），可以看出所有物種的二級(jí)結(jié)構(gòu)均為一個(gè)中心環(huán)（主環(huán)）及4個(gè)螺旋區(qū)（helix）構(gòu)成，每個(gè)螺旋上又有大大小小、或多或少的莖環(huán)（loop）結(jié)構(gòu)。由于沒(méi)有參考模型，部分物種的ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)法顯示。在同一物種中臂環(huán)的數(shù)量、大小和角度沒(méi)有顯著差異，但不同物種間存在顯著差異。通過(guò)比較海桐皮與其易混品的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，各物種在4個(gè)螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)目、大小、位置以及螺旋發(fā)出時(shí)的角度均有明顯差異，因此，依據(jù)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以直觀地將刺桐、喬木刺桐與其易混品區(qū)分。

圖3 海桐皮及其易混品藥用植物ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)

4 討論

DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定以及相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用研究已成為現(xiàn)代生物學(xué)活躍的研究領(lǐng)域和新的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，也是未來(lái)物種鑒定的發(fā)展趨勢(shì)?[20-21]。同傳統(tǒng)中藥材的性狀、顯微、理化鑒定方法一樣，DNA條形碼鑒定技術(shù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性也是業(yè)內(nèi)研究的重點(diǎn)問(wèn)題。所謂穩(wěn)定性是指不同產(chǎn)地、不同批次的樣品均能夠穩(wěn)定獲得DNA條形碼序列。

中藥材因歷史淵源、民間習(xí)俗等原因，長(zhǎng)期存在異藥同名的現(xiàn)象，加之中藥材市場(chǎng)的混亂，造成中藥材品種難以區(qū)別的現(xiàn)象。海桐皮為同名異藥的典型，各地均有該名稱藥材，而基原植物品種相差甚遠(yuǎn)。無(wú)論是海桐皮、浙桐皮還是川桐皮均以樹(shù)皮入藥，難以從外觀上準(zhǔn)確鑒定，尤其是對(duì)于非植物鑒定專業(yè)人員?[22]。因此，本研究從分子鑒定方法入手，建立了一種快速鑒定海桐皮基原植物的方法。

本實(shí)驗(yàn)分析海桐皮及其易混品藥用植物樣品的ITS2序列，結(jié)果顯示所有實(shí)驗(yàn)樣本的PCR擴(kuò)增、測(cè)序成功率及序列獲得率為100%，PCR產(chǎn)物均經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)，并有清晰明亮條帶，說(shuō)明ITS2在海桐皮的鑒定中是有效的DNA區(qū)段，ITS2序列引物及其反應(yīng)條件針對(duì)海桐皮藥用植物穩(wěn)定性較好。在對(duì)藥材樣品進(jìn)行DNA提取時(shí)，需要增大樣品量，同時(shí)延長(zhǎng)水浴時(shí)間，可以提取得到較高質(zhì)量的DNA。海桐皮2種基原種內(nèi)最大遺傳距離均小于其與易混品的種間最小遺傳距離，具有明顯的條形碼間距，說(shuō)明海桐皮及其易混品之間在分子水平上存在的差異是明顯的，通過(guò)K2P距離可很好地區(qū)分開(kāi)。同時(shí)，在基于NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)聚類樹(shù)中，不同物種單獨(dú)聚為一小支，呈現(xiàn)出良好的單系性，ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)所揭示的分子形態(tài)學(xué)特征也直觀顯示出海桐皮與其混偽品的明顯差異。依據(jù)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，海桐皮與其混偽品在4個(gè)螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)目、大小、位置以及螺旋發(fā)出時(shí)的角度均有明顯差異，可以直觀地將海桐皮與易混品區(qū)分。因此，作為DNA條形碼的ITS2序列能夠準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地鑒定海桐皮及其易混品藥用植物，為海桐皮的鑒別提供了新的分子鑒定方法，保證了海桐皮臨床選擇用藥的準(zhǔn)確安全。

DNA條形碼技術(shù)可以直接從基因水平提供鑒定依據(jù)，將有助于非分類學(xué)專業(yè)工作者對(duì)中藥藥用植物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地鑒定，是傳統(tǒng)鑒定方法的補(bǔ)充和拓展，具較好的推廣和應(yīng)用價(jià)值?[23-24]。本研究結(jié)果分析了DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于藥用植物鑒定中的問(wèn)題，證明了ITS2序列作為DNA條形碼能穩(wěn)定、準(zhǔn)確鑒別海桐皮藥用植物，為實(shí)際生產(chǎn)中確認(rèn)藥材基原植物，為保障臨床安全用藥提供有效手段。

志謝：貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院孫慶文、福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓、安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校李林華、遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院許亮、江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部朱育鳳主任、中國(guó)科學(xué)院植物研究所吳寶成、南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院李琳等在實(shí)驗(yàn)樣品采集過(guò)程中提供的幫助。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Molecular identification ofCortex and its adulterants based on ITS2 sequence

TIAN Rong1, WU Yun2, GU Wei1, SHAN Ming-qiu1, GU Yu-chen1, MA Li-jie1, PEI Ling-feng1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China

ITS2 barcoding was used to discriminateand its adulterants in order to provide a new method for the identification of.The total genomic DNAs were extracted from 31 samples ofvar.,.and its adulterants. The ITS2 sequences of these samples were amplified and bidirectional sequenced by PCR. The obtained sequences were submitted to the GenBank and the ITS2 sequences of 38 samples belonging to 15 species were downloaded from the GenBank. Genetic distance, neighbor joining (NJ) phylogenetic tree and secondary structures of ITS2 sequences were analyzed by using MEGA 7.0.We foung the maximum intraspecific genetic distance (K2P distance) was much smaller than the minimum interspecific genetic distance between.var.,.and its adulterants. And the NJ tree showed that.var.,.and its adulterants could be distinguished obviously, which showed high monophyly. In addition, comparing the secondary structure of ITS2 amongand its adulterants, it was found that there were significant differences in the number, size, position of loop, and the angle of helix exsertion.ITS2 sequences, as a DNA barcode, can stably and accurately distinguishfrom its adulterants and it can also provide a new technique to ensure the clinical safety in utilization of Chinese materia medica.

;L. var.(L.) Merr.;Roxb.; adulterants; ITS2; species identification

R282.12

A

0253 - 2670(2021)01 - 0211 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.025

2020-04-09

2019年醫(yī)療服務(wù)與保障能力提升補(bǔ)助資金“全國(guó)中藥資源普查項(xiàng)目”（財(cái)社[2019]39號(hào)）；2018年中醫(yī)藥公共衛(wèi)生服務(wù)補(bǔ)助專項(xiàng)“全國(guó)中藥資源普查項(xiàng)目”（財(cái)社[2018]43號(hào)）；江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（ZDXM-3-24）

田 榮（1990—），女，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源學(xué)。Tel:13851790328 E-mail: tianrong0128@163.com

谷 巍女，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail: guwei9926@126.com

#共同第一作者：吳 云（1980—），男，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴幹苿⒅兴幮滤幯芯颗c開(kāi)發(fā)。Tel: 13775589726 E-mail: m1132321451@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]