豬霍亂沙門(mén)菌C500株的檢定及安全性評(píng)價(jià)

王秀麗， 張 媛， 李 建， 辛凌翔， 李俊平， 蔣玉文， 羅玉峰

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 北京海淀100081)

豬沙門(mén)菌病又稱仔豬副傷寒，具有高度適應(yīng)性和專嗜性，只侵害豬[1]。主要是由豬霍亂沙門(mén)菌、豬霍亂沙門(mén)菌Kunzendorf變型、豬傷寒沙門(mén)菌(S.typhisuis)、豬傷寒沙門(mén)菌Voldagsen變型、鼠傷寒沙門(mén)菌(S.typhimuriru)、德?tīng)柋吧抽T(mén)菌(S.derby)和腸炎沙門(mén)菌等血清型引起。本病常引起較高的死亡率，其中敗血型病死率達(dá)90%，慢性型病死率達(dá)25%～50%，本病傳播快，死亡率高[2]。自20世紀(jì)60年代以來(lái)，仔豬副傷寒活疫苗的研究和應(yīng)用對(duì)本病的預(yù)防起到了重要作用。

仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株為豬霍亂沙門(mén)菌C500株[3]，該菌為豬霍亂沙門(mén)菌C78-2株(CVCC79102)在含有醋酸鉈的培養(yǎng)基中篩選出的弱毒株[4]，本研究對(duì)該菌種進(jìn)行了全面檢定并對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 菌種 豬霍亂沙門(mén)菌C500株(CVCC79500，1967年2月23日凍干，F(xiàn)1)、豬霍亂沙門(mén)菌C78-2株(CVCC79102，1990年3月16日凍干，F(xiàn)5代)[4]，均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供；仔豬副傷寒活疫苗，批號(hào):201710，由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司江西生物藥廠生產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、硫鹽(TG)、TSB、生理鹽水、5% 蔗糖脫脂牛奶、肉肝胃膜消化湯，均購(gòu)自北京中海生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌生化鑒定試紙條，購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃股份有限公司；沙門(mén)菌O7因子血清，購(gòu)自丹麥國(guó)家血清研究所(SSI);革蘭染色液，購(gòu)自山東奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ICR系小鼠、清潔級(jí)日本大耳白兔、健康易感斷奶仔豬，均購(gòu)自四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.4 菌種復(fù)蘇、凍干 用1967年2月23日凍干的豬霍亂款沙門(mén)菌C500株(F1代)，繁殖并凍干1批菌種，批號(hào):20190122(F2代)。具體繁殖及凍干方法參照豬霍亂沙門(mén)菌C78-2株的制備及檢定[5]。

1.5 菌種的檢定

1.5.1 真空度、純粹、剩余水分 均按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》[6]進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.5.2 形態(tài)、培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性和生化特性 按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇版的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定[3]。

1.5.3 特異性 用接種環(huán)取普通瓊脂平板上的單菌落接種含1% 醋酸鉈的普通肉湯10 mL，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察生長(zhǎng)情況。

1.5.4 安全性 健康易感斷奶仔豬的篩選：取10份 體重15 kg以上健康斷奶仔豬的血清，置于56 ℃ 滅能30 min，冷卻至室溫后，與豬霍亂沙門(mén)菌C500抗原做平板凝集試驗(yàn)，其血清與抗原不凝集的豬為健康易感斷奶仔豬。

挑取20190122批凍干菌普通瓊脂平板上典型的單菌落接種普通瓊脂斜面小管，37 ℃培養(yǎng)24 h，將普通瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于4支中管，37 ℃培養(yǎng)24 h，用普通肉湯將菌苔洗下，充分振蕩混勻后對(duì)菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)，將菌液置于2～8 ℃保存，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將置于2～8 ℃保存的菌液稀釋至5×108CFU/mL，皮下注射10只小鼠，0.2 mL/只，觀察21 d；將菌液稀釋至1×1010CFU/mL，皮下注射5只兔子，1 mL/只，觀察21 d；將菌液稀釋至3×109CFU/mL，靜脈注射4頭 體重15 kg以上的健康易感斷奶仔豬，1 mL/頭， 觀察30 d[3]。

本試驗(yàn)同時(shí)設(shè)2個(gè)試驗(yàn)組，試驗(yàn)1組：從仔豬副傷寒活疫苗中分離C500株，按照上述方法制備成1×1010CFU/mL， 注射4只家兔，1 mL/只；試驗(yàn)2組： 按《中國(guó)獸藥典》[6]的規(guī)定，將仔豬副傷寒活疫苗稀釋至2頭份(根據(jù)活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果，2頭份的菌數(shù)約為1×1010CFU/mL)，注射4只家兔，1 mL/只，均觀察21 d。

1.5.5 免疫原性試驗(yàn) 按照安全性試驗(yàn)的方法制備注射菌液，用普通肉湯將菌液稀釋至2.5×109CFU/mL， 肌內(nèi)注射5只體重1.5～2 kg的兔，1 mL/只， 30 d后與條件相同的5只對(duì)照兔皮下注射肉肝胃消化湯培養(yǎng)2代的豬霍亂沙門(mén)菌C78-2強(qiáng)毒菌液2～4個(gè) 最小致死劑量，觀察30 d。

最小致死劑量測(cè)定：在免疫原性試驗(yàn)攻毒前21 d測(cè)毒。將肉肝胃消化湯培養(yǎng)2代的豬霍亂沙門(mén)菌C78-2株用肉肝胃消化湯稀釋至10、15、20 CFU/mL和25 CFU/mL，各劑量的菌液均皮下注射與免疫原性試驗(yàn)同批次的兔子，觀察21 d，記錄測(cè)毒兔子的死亡情況，對(duì)死亡兔進(jìn)行剖檢，記錄剖檢病變。

2 結(jié)果

2.1 真空度、純粹、剩余水分 凍干的150支菌種按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》[6]附錄進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，148/150呈白色或粉色或紫色輝光，2支無(wú)真空的菌種121 ℃高壓30 min處理；隨機(jī)抽取5支真空度測(cè)定良好的菌種進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，5/5純粹；剩余水分測(cè)定結(jié)果為0.9%、0.2%、0.3%、0.7%，均小于4.0%。真空度、純粹、剩余水分測(cè)定結(jié)果均符合規(guī)定。

2.2 形態(tài)、培養(yǎng)特性、血清學(xué)特性和生化特性 C500株在普通瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)20 h，菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略濕潤(rùn)的光滑型，革蘭陰性小桿菌，普通瓊脂平板上的新鮮培養(yǎng)物與沙門(mén)菌O7因子血清出現(xiàn)典型的凝集反應(yīng)(呈片狀凝集)，均符合《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》[3]的規(guī)定。

生化鑒定結(jié)果符合細(xì)菌分類學(xué)中沙門(mén)菌的生化特性，但因經(jīng)過(guò)醋酸鉈的壓力篩選，部分生化特性與其馴化前的菌株C78-2株不一致(表1),說(shuō)明糖發(fā)酵能力較C78-2株有所下降，該結(jié)果與仔豬副傷寒活疫苗的研究報(bào)告中的描述有差異。

2.3 特異性 豬霍亂沙門(mén)菌C500株在含1%的醋酸鉈的普通肉湯中均勻混濁生長(zhǎng)。將10%的醋酸鉈按10%的比例加入普通肉湯時(shí)，因蛋白質(zhì)遇重金屬變性形成大量白色沉淀屬正常現(xiàn)象,不影響C500株生長(zhǎng)。

2.4 安全性 批號(hào)為20190122的C500株小鼠安全檢驗(yàn)：在接種后21 d內(nèi)10/10健活，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

兔安全檢驗(yàn)初次檢驗(yàn)：兔4/5存活，1/5死亡，不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定；重檢：5/5存活，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。具體死亡、剖檢及細(xì)菌分離結(jié)果見(jiàn)表2。死亡兔的剖檢結(jié)果與C500株馴化之前的母株C78-2株一致。試驗(yàn)1組兔4/4存活，注射部位有小結(jié)節(jié)；試驗(yàn)2組兔1/4死亡，死亡的兔注射部位有2 cm×3 cm的破潰，3/4兔有約4 cm×3 cm×3 cm的腫塊。結(jié)果表明：疫苗的凍干保護(hù)劑對(duì)其安全性有影響。

表1 C78-2株與C500株生化特性比較Table 1 Characteristics compare of C78-2 and C500 strain

表2 兔子安全檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Safety test results on rabbits

豬安全檢驗(yàn)初次檢驗(yàn)：1/4死亡，死亡豬極其消瘦；剖檢結(jié)果顯示：腹腔有積液，肝臟腫大且表面和背面均可見(jiàn)大量纖維素性滲出和淤血點(diǎn)，胃黏膜脫落，胃壁變薄，彈性差，腸壁黏膜脫落，腸壁變薄，腸系膜與腹腔內(nèi)臟粘連，脾臟腫大，表面有大量纖維素性滲出；胸腔有大量纖維素性滲出，肺臟出血，胸腔臟器粘連。1/4精神不振，食欲減退，消瘦、跛行、喜臥至臥地不起，后逐漸恢復(fù)至可站立，攻毒30 d后剖檢，可見(jiàn)胸腔臟器與胸壁嚴(yán)重粘連。2/4精神不振、食欲減退，消瘦。未死亡的豬檢驗(yàn)結(jié)束后剖檢可見(jiàn)胃黏膜脫落，胃壁變薄，彈性差。重檢豬與初次檢驗(yàn)為同一批，注射時(shí)比初次檢驗(yàn)大14 d，重檢結(jié)果為豬4/4存活，精神食欲及增重情況明顯差于未免疫豬，安全試驗(yàn)結(jié)束后剖檢可見(jiàn)胸腔由大量纖維素性滲出，胸腔器官嚴(yán)重粘連，腹腔器官正常。

2.5 免疫原性試驗(yàn) C78-2株的測(cè)毒結(jié)果顯示，其對(duì)兔子的最小致死劑量(MLD)為15 CFU/只，按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，5只免疫組和5只對(duì)照組分別攻C78-2株30 CFU/只(2MLD)，30 d后，免疫組5/5保護(hù)，對(duì)照組5/5死亡，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。C78-2株測(cè)毒結(jié)果見(jiàn)表3，C500株免疫原性試驗(yàn)攻毒保護(hù)結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 豬霍亂沙門(mén)菌C78-2株測(cè)毒結(jié)果Table 3 Virulence test results of Salmonella choleraesuis,C78-2 strain

表4 免疫原性試驗(yàn)攻毒保護(hù)結(jié)果Table 4 Immunogenicity test results of challenge protection

3 討論

20100324批仔豬副傷寒C500株菌種(F3代，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所2010年檢定凍干)，檢定記錄中顯示安全檢驗(yàn)初次檢驗(yàn)小鼠10/10存活，兔子3/5存活，2/5死亡，重檢兔子10/10存活，豬4/4存活。20190122批菌種(F2代)，安全檢驗(yàn)初次檢驗(yàn)小鼠10/10存活，兔子4/5存活，豬3/4存活，重檢兔子5/5存活，豬4/4存活。死亡兔和豬的剖檢典型病變基本一致，且死亡兔子的病變與其馴化前的母株C78-2株測(cè)毒兔的剖檢病變完全一致。說(shuō)明豬霍亂沙門(mén)菌C500株的安全性不夠好。重檢豬與初次檢驗(yàn)用豬為同一批次，注射時(shí)比初檢豬大14 d，與初次檢驗(yàn)豬注射相同劑量其健康狀況明顯優(yōu)于初次檢驗(yàn)豬，經(jīng)查閱1978年的研究報(bào)告匯編，該菌種對(duì)于斷奶仔豬是安全的，但對(duì)哺乳仔豬是有一定毒力。20世紀(jì)60-70年代的養(yǎng)殖模式與現(xiàn)在不同，研究報(bào)告中斷奶仔豬是指56～74日齡，哺乳仔豬為27～45日齡，現(xiàn)在斷奶仔豬一般不足25日齡，但增重比在19世紀(jì)的養(yǎng)殖模式下快，現(xiàn)在滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中體重和斷奶仔豬要求的豬在之前的定義下依然是哺乳仔豬，這也是導(dǎo)致本次安全檢驗(yàn)結(jié)果與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不符的主要原因。該結(jié)果對(duì)于仔豬副傷寒活疫苗的臨床應(yīng)用有重要的指導(dǎo)意義。

仔豬副傷寒活疫苗的成品檢驗(yàn)中安全檢驗(yàn)無(wú)本動(dòng)物試驗(yàn)，且安全檢驗(yàn)僅需用2只兔子進(jìn)行檢驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)為存活。以往監(jiān)督檢驗(yàn)或復(fù)核檢驗(yàn)中該產(chǎn)品安全檢驗(yàn)的兔子經(jīng)常出現(xiàn)注射部位破潰的現(xiàn)象，因此，只滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定無(wú)法保證該疫苗的安全性。根據(jù)近幾年對(duì)仔豬副傷寒活疫苗監(jiān)督抽檢及復(fù)核檢驗(yàn)的結(jié)果，生產(chǎn)的仔豬副傷寒活疫苗活菌數(shù)一般在3.5×109～5.5×109CFU/頭份，甚至更高，而該菌種安全檢驗(yàn)豬靜脈注射3×109CFU/頭即可死亡或嚴(yán)重影響其健康狀況，因此不能為滿足活菌計(jì)數(shù)的要求盲目增加疫苗活菌數(shù)。建議對(duì)該產(chǎn)品使用后的安全性進(jìn)行調(diào)研，對(duì)該菌種制備疫苗的安全性和最低有效免疫劑量進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)合臨床應(yīng)用情況，修訂安全性和活菌計(jì)數(shù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。