急性心肌梗死不同類型標本的共同差異基因

傅慶華 彭飛 范文娟 唐毅 劉征宇 鄭昭芬 顏素蘭 潘宏偉

(湖南省人民醫院 湖南師范大學附屬第一醫院 1心內科，湖南 長沙 410005；2檢驗科)

缺血性心臟病(IHD)死亡率不斷上升〔1～3〕，據世界衛生組織(WHO)估計，到2020年將約有2 500萬人死于IHD〔4〕。急性心肌梗死(AMI)是IHD中的急危重癥，院內死亡率為6.7%～16.6%，再住院率5.28%～19.9%〔5～7〕，是冠心病的最大死因。AMI可導致心力衰竭、心源性休克、室壁瘤、栓塞等多種嚴重并發癥，住院率高，并發癥嚴重〔8〕。近年來，肌鈣蛋白作為AMI的診斷指標獲得了認可和推薦，但在如何早期預防和識別AMI的高危人群上仍然缺乏有力的方法。

人類基因表達譜匯編數據庫(GEO)是一個開放的基因表達譜芯片上傳數據庫。近年來，隨著基因表達譜的數據急速增長，目前已積累了一些AMI病例和對照組的基因芯片數據，但這些研究通常集中在一種特定類型的AMI相關樣本中，并且缺乏臨床驗證的證據〔9〕，本研究在AMI不同類型樣本中識別共同差異基因，更具普遍性意義，同時應用定量準確、重現性非常好的實時熒光定量PCR驗證基因表達，更加可靠，并探討這些基因表達差異的生物信息學意義，從而進一步擴充AMI分子致病機制基因方向的研究，為預防及診治AMI提供新的依據。

1 材料與方法

1.1芯片生物分析

1.1.1獲取基因表達譜數據 搜索美國國立生物技術信息中心(NCBI)GEO數據庫，關鍵詞為 “Acute myocardial infarction”,“AMI”,and “Gene expression profile”。如果滿足以下兩個要求的研究將被納入：(1)既有AMI患者又有健康對照組；(2)有不同類型樣本的基因表達分析。

1.1.2原始數據的預處理及差異基因篩選 芯片數據的統計分析采用專業軟件(BRB-ArrayTools 4.3.2 Beta)進行；芯片數據的預處理采用專業算法(JustRMA算法)完成；數據的標準化及過濾采用中位數形式表示，兩組基因表達的比較采用獨立樣本t檢驗。基因過濾的相關條件：①基因中位數的改變不低于2倍，且改變數量級程度為總樣本數的20%以上；②相關基因表達的絕對缺失數據低于總樣本數的50%。利用專業數據工具(Class comparison)比較相應樣本的數據集，找到AMI與正常樣本的差異表達基因。

1.1.3共同差異基因篩選 將兩張芯片篩出的差異基因作韋恩圖(Venn)分析，將兩張芯片差異基因中共同存在的少數基因定義為共同差異基因，并保存其在各芯片中的表達量用作后續分析。

1.1.4火山圖 經t檢驗篩選出表達差異顯著的基因，作火山圖，橫坐標以t檢驗顯著性檢驗P值的負對數-log10(P-value)表示，縱坐標以log2〔倍數變化值(Fold Change)〕表示，經進一步的優化篩選，(如基因表達變化>2倍等)，篩選出顯著差異表達的基因用于后續研究。

1.1.5mRNA聚類分析 使用pheatmap R包對差異基因進行聚類分析以P值大小為標準，將P值越小的前50個差異基因作聚類分析，以高亮的形式顯現出差異基因主要匯集區域。

1.2共同差異基因的臨床驗證

1.2.1AMI患者及對照組 10例AMI患者(AMI組)和10例正常對照(對照組)被納入研究,所有患者符合2015年急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南〔10〕及2016非ST段抬高型急性冠脈綜合征診斷和治療指南〔11〕的AMI標準，AMI組年齡50～ 77〔平均(62.66±7.58)〕歲,男7例、女3例；正常對照由湖南省人民醫院體檢中心提供,年齡41～ 74〔平均(61.20±10.63)〕歲,男6例、女4例。

1.2.2血液RNA的提取 將受試者外周血標本放入2 ml乙二胺四乙酸(EDTA)試管中，進行DNA分離。采用RNeasy微型試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)在血液取樣后24 h內進行RNA分離,并測量分離RNA樣品的RNA濃度和純度。根據說明書，用RT2 HT第一鏈試劑盒(Qiagen,Hilden,Germany)對分離RNA進行cDNA合成，測量分離cDNA的濃度和純度。同時,用cDNA樣本對造血細胞激酶(HCK)、整聯蛋白αM(ITGAM)基因表達進行實時PCR檢測。使用RT2 qPCR引物分析工具包(Hilden,Germany)和mastermixes RT2 SYBR綠色qPCR Mastermix試劑盒(Hilden,Germany),用GAPDH作為內參基因。人HCK基因上游引物:5′-CCA GGT CGG AGG CAA TAC-3′,下游引物:5′-GGG CAA CCA CGA TGA TGT-3′,產物167 bp;GAPDH基因上游引物:5′-CGG ATT TGG TCG TAT TGG G-3′,下游引物:5′-CGC TCC TGG AAG ATG GTG AT-3′,產物213 bp,由上海申友生物公司合成。實時PCR循環條件為:預變性95℃、5 min,變性94℃、30 s,退火50℃(GAPDH基因53℃)、30 s,延伸72℃、30 s,終末延伸72℃、7 min,數據收集40個周期。在每個延長周期的末端收集熒光數據。實時PCR擴增后，對數據進行分析并描繪擴增曲線和熔解曲線。調整基線并確定閾值周期。Ct值為熒光信號到達設定閾值所需的循環次數，ΔCt值是Ct值之間的差值。計算目標基因和內參基因間的ΔCt值。目的基因表達水平計算公式〔12〕：目的基因相對量=2-ΔΔCt。

1.3蛋白互作網絡分析 STRING數據庫可應用于2 031個物種，包含960萬種蛋白和1 380萬種蛋白質之間的相互作用應用。蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)是指兩個或兩個以上的蛋白質分子經過非共價鍵形成蛋白質復合體的過程。應用STRING軟件對差異基因進行PPI分析：登陸STRING官網(https://string-db.org/)，在多個蛋白質(Multiple proteins)選項下提交差異基因列表，有機體(Organism)選項下選擇人類(Homo sapiens)，完成后點擊“SEARCH”。

1.4GO富集分析及KEGG通路分析 應用DAVID及Cytoscape軟件的“Bingo”插件對整合后的差異基因進行GO富集分析及KEGG通路分析。第一步，登陸DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)，選中基因ID轉換功能(Gene ID Conversion)，提交差異基因列表，并在標識符選項(Select Identifier)中選擇官方基因符號(OFFICIAL_GENE_SYMBOL)，列表類型(List Type)選擇基因列表(Gene List)，最后點擊提交清單(Submit List)。

1.5統計方法 采用SPSS19.00進行t檢驗。

2 結 果

2.1差異基因篩選

2.1.1收集基因表達譜數據集 收集序列號為GSE66360和GSE97320的兩張基因表達譜數據集。GSE66360為循環內皮細胞，其中AMI患者樣本49例，正常人樣本50例；GSE97320為血液，其中AMI患者樣本3例，正常人樣本3例。

2.1.2差異基因篩選及聚類分析

2.1.2.1GSE66360差異基因篩選 GSE66360共篩出差異基因349個，其中表達上調56個，下調293個，如NR4A2、GABARAPL1、NFKBIZ、PDE4B，具有統計學意義，部分主要的差異基因如表1所示。

表1 GSE66360部分主要的差異基因

2.1.2.2GSE97320差異基因篩選 GSE97320共篩出差異基因2 425個，其中表達上調1 027個，下調1 398個，如RNASET2、ITGAM、HUWE1、DAZAP2，具有統計學意義(P<0.05，Fold Change>2)，部分主要的差異基因如表2所示。

2.1.2.3共同差異基因篩選 從GSE66360與GSE97320中共有2 774個基因被提取并進行分析，分別來自循環內皮細胞和血液，最后篩選出共同差異基因159個，其中上調基因75個，下調基因84個，共同差異基因如表3所示。其中包括C型凝集素結構域家族(CLEC)6個成員，核糖體蛋白(RP)5個，溶質載體家族(SLC)4個成員,ZNP3個，這些同家族蛋白具有部分相同的結構域。

表2 GSE97320部分主要的差異基因

表3 部分主要的共同差異基因

續表3 部分主要的共同差異基因

2.1.3火山圖 每個數據庫中按上述條件繪制的火山圖見圖1和圖2。以P值-log10為橫軸，以logFC為縱軸，可以很好地將兩張芯片中篩選的上調和下調共同差異基因分別顯示在0軸上下兩側。

2.1.4mRNA聚類分析 兩個數據庫繪制的差異基因聚類圖見圖3和圖4。從圖中可以看出，差異基因可以很好地將正常組織和處理組織分開。

圖1 GSE66360基因火山圖

圖2 GSE97320基因火山圖

圖3 GSE66360差異mRNA熱圖

2.2Real-time PCR驗證

2.2.1兩組臨床資料比較 AMI組與對照組比較在舒張壓、空腹血糖(FBG)上存在統計學差異(P<0.05)；而在年齡、體重指數(BMI)、收縮壓、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)方面差異統計學無意義(P>0.05)。見表4。

2.2.2兩組HCK、ITGAM基因表達情況比較 用平均ΔCt值比較AMI患者與對照組的HCK和ITGAM基因的相對表達量。低的ΔCt值表示基因表達量高。與對照組相比，AMI組的 HCK、ITGAM基因表達量上調(P<0.05)。見表5。

2.3共同差異基因之間的PPI分析 PPI分析表明AMI的共同差異基因之間有復雜的相互關系，見圖5。例如IL1B與IRAK3、IL1R2、NFIL3、ITGAM,LRRK2與NFKBIZ、IRAK3、MAP3K8共同表達，同時NFKBIZ與MAP3K8也共同表達，而且LRRK2與這些基因的相互作用已被實驗證明，ITGAM與多達16個基因有文本采掘證據或共同表達或數據庫證據等多種類型的證據，也有少數基因如MEST和SLC22A4間僅存在文本采掘證據，和其他基因無相互作用，而如RPH3A等基因與其他任何共同差異基因間無相互作用的證據。

2.4核心基因柱狀圖 通過核心基因柱狀圖(圖6)可以看到IL1B、JUN、JRRK2、ITGAM、HCK處于蛋白互作系統的核心位置，對整個網絡起的作用最關鍵，其中最為重要的是IL1B、JUN、JRRK2，分別連接了25、23、22個節點，而ITGAM，既連接16個節點又是主要的共同差異基因之一。

2.5共同差異基因GO富集分析 在上述明確的159個AMI的共同基因里，最顯著的富集生物過程見圖7。最顯著的富集功能是“對生物刺激的反應”(GO:0009607,P=0.000)及“防御反應”(GO:0006952,P=0.000)。此外，它們也富集在“對其他有機體的反應”和“對壓力的反應”中。

圖4 GSE97320差異mRNA熱圖

表4 兩組臨床資料比較

2.6KEGG功能富集分析 使用DAVID對合成后的基因進行KEGG功能富集分析，我們共找到14個相關的KEGG通路，其中最主要的腫瘤壞死因子信號通路、利什曼病、百日咳、AMPK信號通路、礦物質吸收、破骨細胞分化、趨化因子信號通路、幽門螺桿菌感染中上皮細胞信號及細胞因子與其受體相互作用(P<0.05)。見表6。

表5 兩組HCK、ITGAM基因平均ΔCt值比較

圖5 共同差異基因蛋白相互作用網絡

圖6 核心基因

圖7 共同差異基因GO富集分析結果

表6 共同差異基因KEGG通路富集結果

3 討 論

AMI大部分是冠狀動脈動脈粥樣硬化斑塊破裂導致的，以往的研究表明動脈粥樣硬化與高脂血癥、吸煙、糖尿病、高血壓、肥胖等危險因素有關，其動脈血管內皮細胞的改變與炎癥有關〔13〕。近年來基因芯片研究發現了與AMI有關的大量基因表達〔14～16〕，讓我們對AMI的遺傳發病機制有所認識，但這些差異基因是在單一類型樣本中與正常對照組比較后發現的，未見對于不同類型樣本間共同差異基因的研究，而這些共同差異基因在AMI病理及病理生理過程中所發揮的作用可能更具有普遍性意義。通過對血液及循環內皮細胞兩個基因芯片數據集的研究，篩選出了AMI的共同差異基因。

本研究共納入109個樣本，從2 784個差異基因中找到了159個共同差異基因，運用大量的微陣列數據，將誤差率降得更低，使實驗結果變得更可信。

在篩選出的共同差異基因中，PPI分析結果提示，IL-1B、JUN、LRRK2、ITGAM、HCK是影響最大的5個因子。其中一些在以往研究〔17～21〕表明在AMI患者中上調，并有證據表明他們參與到形成AMI的某些途徑中。IL-1β是一種重要的炎癥性細胞因子，其在AMI中上調，癥狀出現后的24 h達高峰〔17,18〕，可持續3 w〔19〕。IL-1β與動脈粥樣硬化有關，其mRNA在人類的高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化中表達增加〔20〕。整合素(ITGAM)是分布于細胞表面的跨膜糖蛋白受體，AMI患者的ITGAM上調可持續28 d甚至更久〔21〕。血小板膜上的ITGAMα2bβ3是GPⅡb/Ⅲa受體，其拮抗劑能發揮強有力地抗血小板作用。目前臨床上使用的ITGAMα2bβ3拮抗劑tirofiban及單克隆抗體阿西單抗(abciximab)廣泛應用于AMI中。LRRK2與JUN未見于AMI的研究，而與帕金森病和阿爾茨海默病關系密切，Eugénie等〔22〕觀察到降脂藥物能推遲和減緩帕金森病的進程,提示帕金森病與脂質代謝有關系。而在本次的實驗中，這兩個因子作為對AMI很重要的共同差異基因，應當對其進行更多的探討及實驗，期待后續有科研工作者對其展開與AMI的系統性研究。

GO富集分析發現，“刺激反應的正向調節” “response to external stimulus” “immune response” “regulation of response to stress”和“defense response”等生物進程在AMI的發病過程中占重要地位。所有這些都可以引起炎癥反應，而以往研究〔23〕顯示炎癥反應在動脈粥樣硬化和AMI過程中發揮重要作用，與本結果高度相符。血管內皮損傷啟動炎癥反應導致動脈粥樣硬化開始，并持續作用于整個過程中，調脂藥物除了降低LDL、升高高密度脂蛋白外還通過抗炎作用治療冠心病。

在KEGG通路分析方面，共同差異基因主要影響 “腫瘤壞死因子信號通路”“利什曼病”“百日咳”和“AMPK信號通路”。腫瘤壞死因子是一種重要的炎癥因子，在AMI后升高，與GO分析結果相呼應〔23〕。cAMP通過調節酶的活性來實現對細胞許多代謝過程的調節。Andrew等〔24〕研究發現在心梗或非心梗導致的心力衰竭動物模型中百日咳毒素能顯著降低由于升高的cAMP水平帶來的正性肌力作用，但未提及百日咳和cAMP與AMI的直接聯系，需要進一步研究明確，但因我們實驗條件有限，還沒有達到可以深入研究其分子機制的條件，期待有條件的研究人員進行后續研究。

通過實時PCR我們驗證了AMI患者血液中共同差異基因中的HCK水平上調，與 Wen等〔25〕研究結果一致。Hck通過LPS/TLR4途徑誘導炎癥因子TNF和IL-6產生，參與動脈粥樣硬化過程〔26〕。可見本研究鑒定的共同差異基因符合臨床實際。但因為經濟及其他原因，無法將所有的共同差異基因做臨床驗證，可在以后的研究中逐步完善。

AMI的生物學指標的檢測近些年不斷取得進步。心肌肌鈣蛋白只在心肌細胞中特異表達，具有高敏感性、高特異性的特點，自從1987年第1次被描述檢測〔27〕，血漿心肌肌鈣蛋白I或T水平已經成為診斷AMI的非常重要的工具〔28～31〕。隨著研究的深入，人們發現它在多種心血管疾病如心力衰竭、急性肺栓塞中的危險分層和短期和長期預后中也具有關鍵作用〔32〕。本研究鑒定的共同差異基因在敏感性與特異性上與肌鈣蛋白比較無優勢，但仍可以就肌鈣蛋白聯合共同差異基因在AMI的危險分層進行研究。本研究識別出的差異基因中有的已經以藥物形式參與AMI的治療，如ITGAM，所以進一步研究這些差異基因具有廣闊的前景。

由于資料有限，本研究僅集中于兩種標本類型，得到的共同差異基因較多，指向性不是特別強。然而，在目前研究中發現的這些共同基因，可以作為進一步探索和證實更多AMI樣本類型的候選差異基因庫。隨著日后基因表達數據的增多，可以在此基礎上進行進一步探索，發現更具有普遍性和代表性的差異基因。此外，芯片數據發布時間以及樣本個數也存在缺陷，因為樣本個數問題，不能完全統計各類人種及地區的不同，也可能不同的地區或人種之間所隱藏的共同差異基因有所不同。基于本研究的上述結果和討論，找到這些共同差異基因并進行相關性分析后，有很多值得進行的后續研究：①在AMI發病過程中的作用機制。②在預測AMI發生中的臨床價值，是否能利用這些共同差異基因早期預測AMI及提前預防。③在AMI治療及預后方面的前景，尋找到AMI治療靶點或作為衡量治療療效的標志。

綜上，AMI不同類型的樣本中存在共同調節基因，且其水平上調，這些基因間存在廣泛的相互作用。期待進一步研究其在AMI中的可能機制及AMI早期預測、診斷、治療中的潛力，使患者獲益。