乙型肝炎病毒剪接特異性蛋白在乙肝病毒感染相關肝細胞癌中的表達及意義

孫龍 蘇健 鄧楊柳 黃圣楷 符微

(海南醫學院第一附屬醫院感染科，海南 海口 570102)

肝細胞癌(HCC)在全球惡性腫瘤發病率中列第6位，每年新發的HCC及其死亡病例有50%以上發生在中國〔1〕，中國HCC發病率居惡性腫瘤第4位，病死率居惡性腫瘤第3位〔2〕。乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起HCC的最主要原因，超過80%的HCC與HBV感染相關〔3〕。HCC早期癥狀多不明顯，臨床診斷困難，病人就診時往往已是進展期，甚至全身廣泛轉移，已錯過最佳治療時機，預后差。因此，尋找特異性好、診斷價值高的標志物及有效的治療靶點，是目前研究HCC的主要熱點之一。乙型肝炎病毒剪接特異性蛋白(HBSP)在慢性HBV感染患者中十分常見，可影響肝細胞功能，具有重要的致病意義〔4〕。本研究觀察HBSP在HBV感染肝臟疾病中的表達變化，并探討其對HCC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1病例資料 選取2018年7月至2019年12月海南醫學院第一附屬醫院門診及療區的HBV感染相關疾病患者152例，其中慢性HBV攜帶者(CHBC)40例，男23例，女17例，平均年齡(38.8±15.2)歲；慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者42例，男30例，女12例，平均年齡(43.8±10.6)歲；肝硬化(LC)患者38例，男27例，女11例，平均年齡(48.5±12.7)歲；HCC患者32例，男25例，女7例，平均年齡(45.6±16.2)歲。所有患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》、《原發性肝癌防治指南(2011年版)》相關診斷標準，就診前均未接受抗HBV治療，性別、年齡無統計學差異(P>0.05)。

1.2分析方法 靜脈采血、分離血清，采用熒光定量檢測HBV-DNA水平；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測甲胎蛋白(AFP)、AFP異質體(AFP-L3)、AFP-L3%水平；實時定量PCR檢測HBSP水平。病毒DNA提取試劑盒，QIAamp MinElute Virus Spin產品；HBSP上游引物：CCGCGTCGCAGAAGATCT；下游引物：ATGGGAATACAGGTGCAATTTCC和HBSP標準品(HBSP全長506 bp)引物由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成并純化。

實時定量PCR檢測HBSP：取200 μl血清樣本，使用病毒DNA提取試劑盒提取血清病毒 DNA作為模板，采用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法實時定量PCR專用試劑TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(KaTaRa，日本)，用Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀進行檢測。反應體系為25 μl：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5 μl、上游引物和下游引物(20 pmol/L)各1 μl、DNA模板2 μl和8.5 μl滅菌超純水。擴增條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，95℃ 10 s，39個循環，熔解曲線繪制從 65℃到 95℃。反應結束后確認擴增曲線、熔解曲線并記錄Cq值，進行檢測方法學評估及實驗分析。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0及 GraphPad Prism6 軟件行單因素方差分析、Kruskal-WallisH檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1各組血清HBSP水平(cq值)比較 與CHBC組(29.81±5.34)比較，CHB組(31.74±5.66)、LC組(34.73±4.11)及HCC組(39.94±3.79)組血清HBSP的Cq值均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，HCC組>LC組>CHB組，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2各組HBV-DNA水平比較 與CHBC組(7.35±0.48 log10IU/ml)比較，CHB組(4.34±0.35 log10IU/ml)、LC組(4.57±0.24 log10IU/ml)及HCC組(4.39±0.21 log10IU/ml)血清HBV-DNA水平均明顯降低(P<0.01)，LC、HCC組血清HBV-DNA水平明顯低于CHB組(P<0.05)，而兩組LC、HCC無統計學差異(P>0.05)。

2.3各組血清AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比較 血清AFP水平方面，與CHBC組比較，HCC組、CHB組及LC組均明顯升高(P<0.05,P<0.01)，且HCC組>CHB組>LC組，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，但HCC組AFP水平相差較大，部分患者完全正常。血清AFP-L3、AFP-L3%水平方面，與CHBC組比較，LC組升高(P<0.05)，而HCC組明顯升高(P<0.01)，且明顯高于CHB、LC組(P<0.01)，見表1。

表1 各組血清AFP、AFP-L3、AFP-L3%水平比較

2.4相關性分析 各組血清HBSP水平與血清HBV-DNA、AFP無明顯相關性(P>0.05)，與AFP-L3、ALP-L3%水平呈一定效應關系，呈正相關(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表2 血清HBSP水平與HBV-DNA、AFP、AFP-L3、AFP-L3%相關性(r/P值)

3 討 論

目前，針對HCC臨床診斷、早期篩查臨床上應用最為廣泛的AFP在轉錄水平上受多種因素調控，CHB、LC患者也可出現低-中度升高，而部分低分化型HCC患者正常，其特異性并不理想。AFP-L3僅由肝癌細胞分泌產生，與影像學比較，對HCC早期診斷有9～12個月提前時間〔5〕，血清AFP-L3%、AFP-L3陽性率與癌灶大小、腫瘤分期呈正相關，對于判斷HCC的腫瘤病理學特性具有一定意義〔6〕，在AFP濃度<200 ng/ml時，AFP-L3%對HCC的確診具有重要的臨床意義〔7〕。維生素K缺乏或拮抗劑-Ⅱ誘導蛋白(PIVKA-Ⅱ)是診斷HCC的另一個重要指標，可與AFP互補〔8〕，聯合AFP可提高HCC檢出率，且在HCC發生、發展過程中有一定的優勢，可用于監測病情變化〔9〕。但由于多種條件限制，AFP-L3、AFP-L3%及PIVKA-Ⅱ在臨床實際工作開展并不多，目前對于HCC的臨床診斷仍然主要依賴于AFP、影像學和肝活檢，尚缺乏具有高度特異性的實驗室檢測指標，早期臨床診斷依舊相對比較困難。眾所周知，慢性HBV感染是LC、HCC最主要原因，我國77.22%的LC患者由HBV感染引起〔10〕，超過84%的HCC患者與HCC相關〔11〕。早期研究認為，HBV基因變異是CHB病程發展方向的重要決定因素〔12〕。HBV基因組剪接變異體與HBV的持續性感染和致病性存在密切關系〔13～15〕。HBSP可影響肝細胞骨架的重塑、細胞內物質代謝等方面，與肝細胞的增生、遷移及代謝異常密切相關，可能在HBV感染發病機制中具有重要作用〔16〕。在HCC確診前HBSP有明顯增加，提示血清HBSP或許可以成為一個預測HCC發生的有效手段〔17〕。另有研究結果提示，HBSP介導的HCC細胞或原代人肝細胞(PHH)對激動性抗Fas抗體(CH11)或FasL誘導的細胞凋亡具有抗性，表明HBSP通過增強PI3K/Akt活性來防止Fas誘導的肝細胞凋亡，可能有助于慢性感染過程中被感染肝細胞的存活和持久性〔18〕。

本研究結果提示HBV引起的反復免疫應答反應致HBV-DNA低表達，不能完全清除或有效抑制HBV，肝臟炎癥反復發生，是肝細胞損傷的主要機制，是進展為LC、 HCC 的重要因素。AFP影響因素較多，肝臟炎癥明顯時肝細胞再生可致血清AFP 升高，而部分低分化型HCC血清AFP正常，臨床診斷HCC的特異性下降。血清AFP-L3、AFP-L3%對于HCC更具臨床診斷意義，與相關報道一致〔5～7〕。另外，本研究結果提示HBSP與HBV感染相關肝臟疾病關系密切，可能是HCC獨立影響因素，具有一定的臨床診斷價值。

綜上，HBSP水平在HBV感染相關HCC中表達升高，在其發病機制中可能具有重要作用，特別是對HCC的臨床診斷、早期篩查或許具有重要意義。至于HBSP參與HBV感染相關肝臟疾病(特別是HCC)的確切機制，能否成為HCC新的、特異性好、診斷價值高的檢測指標，或成為HCC有效的治療靶點，還有待進一步研究。