衰老對小鼠角膜厚度和眼表的影響

章爽 高桂平 黎彪 李秋玉 葛倩敏 梁榮斌 石文卿 邵毅

(南昌大學第一附屬醫院眼科，江西 南昌 330006)

隨著年的增加引發的與年齡有關的慢性疾病不斷增加，其中，老年干眼癥患病率呈逐年增長趨勢〔1〕，目前國內針對老年人干眼的發病危險因素的研究文獻較少，衰老如何參與老年干眼發病過程的機制及是否會導致角膜結構及角膜厚度變化仍不清楚，本文通過眼前段光學相干斷層掃描血管成像(OCTA)檢測衰老對嚙齒動物小鼠所引起角膜厚度變化及通過相關技術檢測衰老對小鼠基礎淚液分泌試驗(SIT)、淚膜破裂時間(BUT)、角膜熒光素染色(FL)評分的影響，進而進行相關性分析以評估臨床和體外測量之間的潛在關聯。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取12只由南昌大學醫學院動物中心提供的健康的、體重為18～21 g、鼠齡為6周齡的雌性C57小鼠(均為 SPF 級實驗動物)，使用裂隙燈顯微鏡及眼底鏡檢查眼前節、眼底無異常，飼養至2月齡和24月齡時分別進行實驗。在研究過程中，保持在標準化的環境中飼養:恒溫為(23±1)℃，相對濕度60%±5%，12 h明暗周期中(早上8∶00到晚上8∶00)，小鼠均給予相同的水量和食物，對實驗動物的使用和喂養均符合動物倫理學并遵循 《 實 驗 動 物 管 理 條 例 》，在實驗過程中盡可能減少實驗動物的應激，處置動物時盡量減少實驗動物的痛苦和傷害〔2〕，由于月齡為24月齡的C57小鼠的年齡相當于一個大約65歲的人類，這可能會提供關于衰老如何影響人類眼表的關鍵見解〔3〕，取24月齡小鼠為研究對象，以小鼠年齡變化作為自身對照，實驗分為A、B兩組，均取小鼠右眼作為實驗眼，A組為飼養至2月齡C57小鼠(12只)，B組飼養至24月齡C57小鼠(12只)。

1.2實驗方法

1.2.1BUT檢測 根據文獻〔4〕下方結膜囊內滴入1滴 1% 熒光素鈉溶液，使其瞬目，在裂隙燈顯微鏡鈷藍光下觀察，正常的角膜上皮不染色，染為綠色代表角膜上皮缺損，記錄角膜染色區出現第1個破裂點的時間。

1.2.2SIT檢測 根據文獻〔5〕下方結膜囊內滴一滴鹽酸丙美卡因(愛爾凱因)滴眼液表面麻醉后,在小鼠右眼外眥中外1/3交點的地方放置酚紅棉線(天津京明新技術發展有限公司，中國天津)的一端，線的邊緣輕輕鉤住下眼瞼，并計時60 s,指示卡顏色由黃色變紅色時立即測量，用游標卡尺測量酚紅棉線紅色部分的潤濕長度(以mm為單位)，計算淚液分泌量。

1.2.3FL測定及評分 根據文獻〔6〕方結膜囊內滴入1滴1%熒光素鈉溶液,使其瞬目，觀察裂隙燈鈷藍色光下角膜上皮著染，參考國家眼科研究臨床干眼評分系統〔7〕，分為 0 ～4分：0分：沒有染色；1分：輕微點狀著染，少于30點；2分：點狀染色超過30點，但沒有成片；3分：嚴重彌漫性染色，但沒有斑塊；4分：有熒光素斑塊。

1.2.4角膜上皮及全層厚度 所有小鼠角膜厚度的測量采用 AngioVue OCTA 系統，模式調為視網膜成像模式(AngioRetina 模式)，采用分頻輻去相關血管造影算法(SSADA) 進行成像〔8〕，橫向分辨率設置為 15 μm，軸向分辨率設置為 5 μm，并使用前段透鏡光學適配器鏡片，采用 840 nm 波長、寬度22 μm 的光源獲取 3D 掃描圖像〔9〕，對所選小鼠進行檢測時，由于OCTA 系統默認的聚集是針對視網膜，所以在測量角膜全層及角膜上皮厚度時要關閉自動聚焦功能〔10,11〕，確定掃描中心，雙眼定期給予生理鹽水滴眼液，以維持角膜水合。以上實驗，進行每次檢查時應注意控制變量，實驗應由同一技師在相同的時間、地點，相同的照明亮度、濕度及溫度下操作。

1.2.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗、Mann-WhitneyU檢驗。

2 結 果

2.1兩組SIT、BUT和FL評分比較 B組BUT 明顯短于A組，SIT明顯長于A組，FL評分明顯高于A組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 兩組SIT、BUT 和 FL 評分比較

2.2兩組角膜上皮厚度和角膜全層厚度比較 角膜較清亮，晶狀體尚清，B組角膜稍水腫，可見晶狀體混濁。見圖1。B組平均上皮厚度小于A組，而平均角膜全層厚度大于A組，差異具有統計學意義(P<0.05)。 見圖2、表2。

圖1 兩組角膜眼前節及角膜熒光染色(×16)

圖2 兩組小鼠角膜上皮及全層厚度測量(×16)

表2 兩組角膜厚度比較

2.3兩組角膜極值比較 兩組角膜厚度及角膜上皮厚度均有顯著差異(P<0.05)，但兩組角膜厚度及角膜上皮(MIN-MAX) 差值比較無統計學意義(P>0.05) 。見表3。

表3 兩組角膜上皮和角膜厚度極值比較

3 討 論

干眼癥為任何原因所致淚液質或量，或動力學的異常，從而導致淚膜穩定性下降，并伴有眼部不適和(或)眼表組織損害為特征的多種疾病的總稱。干眼患者輕者常表現為眼部干澀感，異物感、燒灼感及視疲勞等，重者可導致角膜上皮損害并形成角膜新生血管〔12〕，干眼是一種復雜的影響眼表和淚腺的多因子疾病，主要由細胞凋亡、炎癥及性激素水平失調等機制所致〔13〕，清楚了解病因將有助于本病的防治。

正常的眼表和淚腺組織均有豐富的神經支配，通過完整的神經反射環路完成淚液分泌功能，由于環境變化引起的角膜傳入神經元的激活可增加了基底淚液的分泌，但與此矛盾的是，有研究表明，淚液分泌增加與中央和外周角膜的基底下神經叢(SBNP)和表面神經末梢(SNTS)的神經總和長度減少相關，多模態角膜神經的亞突起主要表達瞬時受體電位(TRP)M8或TRP陽離子通道Ⅴ亞家族成員(TRPV)1傷害性感受器〔14〕，TRPM8角膜神經主要參與淚液調節及負責角膜表面冷卻，通過對嚙齒動物相關研究，老化可能使這些冷感受器發生結構和功能上的改變，并且隨著年齡的增加，數量會減少〔15〕，因此，老年小鼠較高的淚液分泌可能與TRPM8特異性神經信號的減少有關，此外，隨著年齡的增大，鼻淚管結構的改變會導致較低的淚液排泄率〔16〕，推測老年小鼠較高的淚液分泌可能與TRPM8特異性神經信號的減少及鼻淚腺系統的變化有關，這使得衰老小鼠的淚液分泌較多。

雖然老年小鼠有較高的淚液分泌量，但在我們實驗中觀測到，老年小鼠的BUT縮短，這是由于淚膜層由脂質層，水液層，黏蛋白層三層組成，淚膜厚度較薄，僅約3 μm〔17〕，因此更容易發生損傷，隨著年齡的增加，淚腺和瞼板腺可能會發生導管周圍纖維化，腺泡細胞萎縮和淋巴細胞浸潤等變化，此外，淚腺及瞼板腺的分泌還受到激素的影響，雄激素可以增加淚腺分泌，同時還可以促進和調節瞼板腺的分泌〔18〕，在一些雌性患者中，隨著年齡的增加，體內的激素水平越來越低，這使得瞼板腺、淚腺的分泌功能也逐漸降低，而瞼板腺的功能降低會使脂肪層完整性的降低〔10，19〕，脂肪層在調節眼表淚膜蒸發中起著關鍵作用，雖然老年小鼠的水液層增多，但脂質層是減少會造成淚膜的穩定性降低，淚膜容易破裂，這使得衰老小鼠淚膜更容易破裂。

角膜是機體神經末梢分布密度最高的器官之一，豐富的感覺神經來源于三叉神經的眼支，感覺神經纖維從睫狀神經長神經發出分支，穿過前彈力層在上皮下形成上皮下神經叢，從基底下神經叢開始，垂直方向的軸突向前突出，終止于淺上皮，這使得角膜敏感度較高，有研究表明，小鼠淺上皮和基底區角膜神經總和長度和垂直神經投射密度會隨著年齡的增長顯著降低，而與此移植的是小鼠的機械角膜敏感度隨著年齡的增長而降低，這與基底下神經軸突的密度降低是相平行〔19〕，角膜神經可以檢測外界傷害，有害物質及溫度，從而做出相應的反射，減少傷害，隨著年齡的增加，角膜神經支配減少，這使得角膜保護機制降低，從而容易受到角膜損傷，本實驗發現老年小鼠的上皮厚度降低，FL增加可能與年齡引起的角膜神經減少所造成的角膜防御機制降低有關。

使用OCTA來評估角膜結構過程中，發現老年小鼠上皮厚度變薄，而角膜全層厚度增厚，由于老年小鼠淚膜穩定性降低，同時加上各種炎癥因子的影響，使得角膜基質活性代償性增強，膠原纖維開始合成，使得角膜基質層增厚，此外，角膜內皮層的Na+-K+-ATP 酶泵維持基質層的半脫水狀態，使角膜保持透明狀態，隨著年齡的增加，角膜內皮數量隨著年齡增加而減少，細胞代償性增加，Na+-K+-ATP 酶泵功能相對降低，導致角膜基質層水腫增厚，而基質細胞所組成的基質層占角膜厚度的 90%，因此這使得角膜上皮全層厚度也相應地增厚〔20〕，因此推測這可能是衰老引起角膜全層厚度增加的原因。

綜上，應當加強對老年干眼患者的重視，了解發病高危因素，及時采取相應的防治措施，及時治療，從而提高老年人的生活質量。