西黃丸對大鼠乳腺癌癌前病變的阻斷作用及對NF-κB蛋白表達的影響

李德輝 蘇伊璠 范煥芳 孫春霞 韓長輝 馬盼 閆嬌嬌 呂素君

(河北中醫學院附屬醫院 河北省中醫院，河北 石家莊 050011)

乳腺癌發病率和死亡率居全球女性惡性腫瘤之首，嚴重威脅女性身體健康和生命安全〔1〕。現代研究證實，乳腺癌的發生經歷“正常細胞→單純性增生→非典型增生→原位癌→浸潤性癌”的連續病變過程，癌前病變是乳腺癌發生發展的必經階段，而在該階段采取積極的干預措施可以阻斷甚至逆轉癌變進程〔2〕。干預乳腺癌癌前病變，阻斷其向乳腺癌發展，是目前防治乳腺癌的研究關鍵。乳腺癌癌前病變屬于中醫“乳癖”范疇，痰毒瘀結是其發生發展的核心病機。經典名方西黃丸具有清熱解毒、化痰散結、活血化瘀、消腫止痛之功效，經臨床實踐用于治療乳腺癌癌前病變、防治乳腺癌療效顯著〔3〕。本課題組前期研究發現〔4〕，西黃丸浸提液可抑制乳腺癌癌前病變細胞活力、誘導細胞凋亡，其作用機制可能與其抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路mTOR與血管內皮生長因子(VEGF)蛋白的表達相關。本研究以7,12-二甲基苯并蒽(DMBA)協同雌孕激素序貫方法復制SD大鼠乳腺癌癌前病變模型，觀察西黃丸對模型大鼠乳腺癌癌前病變的阻斷作用及對核轉錄因子(NF)-κB蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物 6周齡SPF級健康未育SD雌性大鼠60只，體重(180±20)g，由河北省實驗動物中心提供，動物合格證號：1705351，自由進食、飲水，常規飼養1 w后進行實驗。

1.2藥物及試劑 苯甲酸雌二醇注射液，寧波第二激素廠生產；黃體酮注射液，寧波第二激素廠生產；枸櫞酸他莫昔芬片，揚子江藥業集團有限公司，批號：17041311；DMBA，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司(TCI)，CAS57-97-6；西黃丸，浙江天一堂藥業有限公司，批號：1703011；NF-κB鼠單克隆抗體，美國Abcam公司。DMBA配制：精密稱取DMBA，按7 mg/ml比例溶于芝麻油，置于60℃水浴箱，超聲振蕩溶解備用。西黃丸水溶液制備：根據實驗需要，實驗前一天將西黃丸浸泡于少許蒸餾水中，以恰能浸泡藥物顆粒為準，實驗當日將浸泡軟的西黃丸碾碎，用蒸餾水配制成濃度分別為27 mg/ml、55 mg/ml、137 mg/ml的西黃丸水溶液備用。他莫昔芬水溶液配制：根據實驗需要用蒸餾水配制成0.4 mg/ml的他莫昔芬水溶液。

1.3儀器 ASP200S全自動組織脫水機，德國徠卡公司；EG11508組織包埋機，德國徠卡公司；RM2255全自動輪轉切片機，德國徠卡公司；LEICA DMRA2照像顯微鏡，德國徠卡公司；Leica Qwin 圖像分析系統，德國徠卡公司。

1.4動物模型復制〔5〕實驗第1天用溶解有DMBA的芝麻油，按1 ml/100 g比例給大鼠一次性灌胃。第2天起，按照5 d為1個周期〔第1～3天，大鼠后腿內側注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/(kg·d)；第4天，大鼠后腿內側注射黃體酮4 mg/(kg·d)；第5天觀察〕，連續12個周期，建立乳腺癌癌前病變大鼠模型。

1.5分組及給藥方法 按體重分層隨機分組法將60只大鼠分為正常對照組10只、疾病模型組50只。給藥方法分別如下：正常對照組：一次性灌胃不含DMBA的芝麻油1 ml/100 g，常規飼養；疾病模型組：按1.4造模方法復制模型，常規飼養。10 w造模成功后，將疾病模型組造模成功大鼠按照體重分層隨機分組法分為疾病模型組，他莫昔芬組，西黃丸低、中、高劑量組共5組，每組10只，給藥方法如下：疾病模型組：常規飼養；他莫昔芬組：給予他莫昔芬水溶劑(4 mg/kg)1 ml/100 g灌胃，每天1次，連續28 d，常規飼養。西黃丸低、中、高劑量組：分別給予西黃丸水溶劑低(270 mg/kg)、中(550 mg/kg)、高劑量(1 370 mg/kg)1 ml/100 g灌胃，每天1次，連續28 d，常規飼養。

1.6標本采集 于動物實驗過程的第14周末為取材時間點。取材前各組大鼠禁食不禁水24 h，以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉后。無菌條件下取大鼠胸腹部6對乳腺及其周圍皮膚、皮下組織約1.0 cm×1.0 cm。中性甲醛固定，用于蘇木素-伊紅(HE)染色、免疫組化檢測。

1.7大鼠乳腺組織形態學觀察 取各組大鼠6對部分乳房，用10%甲醛固定，梯度酒精脫水，常規石蠟包埋切片(厚4 μm)。常規HE染色，參照文獻在光鏡下進行組織學觀察其增生程度〔6〕。

1.8大鼠乳腺組織NF-κB蛋白表達的檢測 取各組大鼠第2對部分乳房，用10%甲醛固定，梯度酒精脫水，常規石蠟包埋切片(厚4 μm)。用免疫組化法檢測大鼠乳腺組織NF-κB蛋白的表達，按免疫組織化學SP法操作技術常規進行，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染。以已知NF-κB陽性切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。NF-κB陽性表達的判斷標準：NF-κB陽性染色定位于細胞質中，呈棕黃色顆粒，偶見于胞核呈棕黃色。使用Leica Qwin圖像分析系統對NF-κB蛋白表達的陽性面積和平均光密度進行定量分析。

1.9統計學方法 使用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析、秩和檢驗。

2 結 果

2.1西黃丸可阻斷、逆轉乳腺癌前病變大鼠乳腺組織病理形態學變化 各組大鼠乳腺組織增生程度不同(χ2=358.58，P=0.000)，其中疾病模型組增生程度最重，與正常對照組比較，疾病模型組增生程度差異有統計學意義(Z=14.529，P=0.000)；與疾病模型組比較，他莫昔芬組、西黃丸各劑量組增生程度顯著較低(P<0.05，P<0.01)。見表1，圖1。

表1 西黃丸對乳腺癌前病變大鼠模型乳腺組織病理程度的影響(n=10，n)

圖1 各組乳腺組織病理形態學變化(HE，×100)

2.2西黃丸可下調乳腺癌癌前病變大鼠乳腺組織NF-κB蛋白的表達水平 與正常對照組比較，疾病模型組NF-κB蛋白表達明顯增加(P<0.01)。與疾病模型組比較，他莫昔芬組與西黃丸各劑量組可顯著降低NF-κB蛋白表達水平(P<0.01，P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組乳腺組織NF-κB蛋白表達(免疫組化，×200)

表2 西黃丸對乳腺癌癌前病變大鼠模型乳腺組織NF-κB蛋白表達的影響

3 討 論

乳腺癌變的發病機制至今尚未完全明晰，近年出現的多種關于該病發病機制的理論學說，如雌激素及其受體介導學說，孕激素受體介導學說，細胞增殖凋亡失衡理論，癌基因、抑癌基因表達異常學說，血管生成相關因子理論等，雖然觀點不一，但都認為乳腺癌變的發生是多種因素共同作用的結果。乳腺癌癌前病變動物模型是研究乳腺癌癌前病變病因、發病機制、評價治療效果的重要實驗工具，目前乳腺癌癌前病變動物造模方法一般通過自發性、移植型、誘發型3種途徑〔7〕。DMBA聯合雌孕激素序貫建立的乳腺癌癌前病變模型是目前得到普遍認可的動物模型之一，DMBA對乳腺組織具有極高的選擇性和特異性(70%～80%)〔8〕，外源性或內源性雌孕激素是導致乳腺癌變重要因素，DMBA與雌孕激素聯合應用能夠明顯提高乳腺癌癌前病變的發生率〔9〕。本項目采用DMBA聯合雌孕激素序貫成功建立SD大鼠乳腺癌癌前病變模型，陽性對照藥他莫昔芬的給藥劑量通過參照文獻和預實驗確定〔10〕，西黃丸劑量參照陳奇〔11〕主編的《中藥藥理研究方法學》進行人與大鼠劑量折算而來。研究結果表明正常對照組大鼠乳腺組織全部為正常腺體，與正常對照組比較，疾病模型組在第10周時可見同一大鼠的多個乳腺出現不同程度的導管上皮增生和非典型增生，第14周見到較多的Ⅲ級非典型增生及少數導管內癌發生，此模型經過乳腺導管上皮細胞“正常→單純性增生→非典型增生→原位癌→浸潤性癌”的動態發展過程，與人乳腺癌病變組織病理形態學特點非常類似。與疾病模型組比較，他莫昔芬組大鼠乳腺組織增生程度降低，說明他莫昔芬可有效阻斷此模型大鼠乳腺癌前病變的發生發展，故此模型是本項目研究的較理想模型。與疾病模型組比較，西黃丸各劑量組大鼠乳腺組織增生程度降低，說明西黃丸可減輕DMBA聯合雌孕激素序貫誘導的乳腺癌癌前病變大鼠乳腺組織病理形態學變化。

現代藥理研究表明〔3,12〕，西黃丸可通過抑制雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)表達，逆轉P53基因突變，抑制癌基因Bc1-2的過表達，提高外周血白介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ水平及CD3+、CD4+、免疫共刺激分子B7-1含量，增強免疫清除功能，逆轉乳腺癌癌前病變非典型增生的病理變化，阻斷乳腺癌的發生發展，但未見其關于調控NF-κB分子方面的報道。在腫瘤細胞中，NF-κB具有抗凋亡、促進腫瘤細胞存活的功能。很多研究認為〔13,14〕，在乳腺癌的發生、發展中NF-κB的活化起決定性作用，NF-κB蛋白在乳腺癌中的過表達與組織學分級有關，隨著乳腺癌的發生發展，NF-κB蛋白水平在病變乳腺中的表達呈動態增高，說明在乳腺癌變中NF-κB異常活化，一定程度上促進了乳腺癌的發生發展。本研究表明NF-κB在模型大鼠乳腺癌癌前病變組織中異常活化過表達，西黃丸可下調乳腺癌癌前病變模型大鼠乳腺組織NF-κB蛋白的表達。

綜上所述，西黃丸可減輕DMBA聯合雌孕激素序貫誘導的乳腺癌癌前病變大鼠乳腺組織病理形態學變化，其機制可能與其下調乳腺組織中NF-κB蛋白的表達相關。本研究結果進一步拓寬了西黃丸治療乳腺癌癌前病變，預防乳腺癌的作用機制，為下一步進行西黃丸通過抑制NF-κB信號通路阻斷乳腺癌發生、發展、轉移的研究提供了基礎。