左歸丸含藥血清對阿爾茨海默病細胞模型雌激素受體表達的影響

劉宏 仲麗麗 于穎 張雨薇 楊婧 代巧妹 李冀

(1黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院)

阿爾茨海默病(AD)是一種不可逆轉的神經退行性疾病〔1〕，在中醫屬于“癡呆”范疇，多發生于老年人，由氣虛和腎虛所致，結合“腎腦相通”中醫理論，補腎治療AD存在一定的合理性〔2〕。左歸丸是傳統補腎陰藥物〔3〕。據報道，左歸丸可通過促進熱休克蛋白的表達，抑制AD模型神經細胞的凋亡〔4〕，并且對 AD 大鼠海馬和皮質神經元細胞使抗氧化能力增強〔5，6〕。本課題組前期實驗發現左歸丸可以改善腦缺血大鼠的記憶力〔7〕及提高大鼠腦內雌激素受體(ER)的表達，并且運用ER拮抗劑之后，左歸丸的這種神經保護作用大部分消失〔8〕。因此，考慮左歸丸對神經元的保護作用可能與下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)存在聯系。本實驗在穩定的AD細胞模型上，探討左歸丸對細胞存活的影響及對ER表達的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 Aβ1～42小鼠單克隆抗體(吉爾生化)，左歸丸，購自北京同仁堂藥店。ER單克隆抗體(wanleibio)、活化的半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-Caspase)3單克隆抗體(wanleibio)、羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)(wanleibio)內參抗體 β-actin(wanleibio)、電化學發光(ECL)液(wanleibio)、大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞(PC12)(procell)。

1.2主要儀器 酶標儀(BIOTEK)、電熱恒溫培養箱(天津泰斯特)、凝膠成像系統(北京六一)超純水系統(Heal Force 公司)、超速冷凍離心機(湖南湘儀)、CO2培養箱(上海力申)、超凈工作臺(蘇州凈化)、RPMI-1640培養基(Gibco)。

1.3藥物配制 將5 mg Aβ1～42溶于28.3 μl的二甲基亞砜(DMSO)中，配成濃度為40 μmol/L的儲存液，用超純水稀釋，分裝保存。取100 μl的Aβ1～42置于37℃培養箱7 d，進行老化處理。

1.4分組 對照組、模型組、Aβ1～42+低濃度含藥血清組(干預組1)、Aβ1～42+中濃度含藥血清組(干預組2)、Aβ1～42+高濃度含藥血清組(干預組3)。

1.5給藥 正常培養PC12細胞，給予Aβ1～42(40 μmol/L)處理作為模型組，藥物干預組分別給予低(3%)、中(5%)、高濃度(10%)的含藥血清。

1.6MTT法檢測細胞活力 分別將24 h、48 h、72 h細胞加入MTT染色液，酶標儀測定OD值。

1.7Western印跡法 檢測含藥血清干預前后細胞中雌激素受體(ER)、Cleaved-Caspase3蛋白的表達。Cleaved-Caspase3(1∶500稀釋)4℃孵育12 h，目的分子量20 kD，ER1(1∶500稀釋)，4℃12 h，目的分子量66 kD。

1.8統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1MTT檢測結果 與對照組比較，模型組細胞存活率顯著下降(P<0.05)，與模型組比較，干預組1細胞存活率顯著增加(P<0.05)；與干預組1比較，干預組2細胞存活率顯著增加(P<0.05)；與干預組2比較，干預組3細胞存活率顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.2Cleaved-Caspase3表達情況 與對照組比較，模型組Cleaved-Caspase3表達顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，干預組1 Cleaved-Caspase3表達顯著下降(P<0.05)；與干預組1比較，干預組2 Cleaved-Caspase3表達顯著下降(P<0.05)；與干預組2比較，干預組3 Cleaved-Caspase3表達顯著下降(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組細胞活力及Cleaved-Caspase3、ER1蛋白表達比較

2.3ER1表達情況 與對照組比較，模型組ER1表達顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，干預組1 ER1表達顯著增加(P<0.05)；與干預組1比較，干預組2 ER1表達顯著增加(P<0.05)；與干預組2比較，干預組3 ER1表達顯著增加(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 Western印跡檢測各組細胞Cleaved-Caspase3、ER1表達

3 討 論

AD臨床治療常以補腎化痰、補腎開竅、補腎活血為常見的配方組合〔9，10〕，其中，補腎是關鍵。中醫藏象學認為“腎主骨生髓通于腦”〔11〕，腎氣充盈，頭腦靈活，腎氣虧虛，健忘智衰。本課題組從中醫傳統理論出發，認為老年癡呆的主要病機是腎氣的缺損。腎虛導致腦無所養，腦衰健忘。故治療當用補腎法〔12〕。有報道指出，左歸丸對衰老小鼠AD模型有保護作用，通過抑制自由基生成保護神經元免受氧化損傷，防治AD〔13，14〕。臨床觀察發現，AD患者行穴位電針療法配合加味左歸丸治療后，療效確切，能顯著提高患者的認知功能，提升其生活自理能力和生活質量〔15〕。王恩龍〔16〕用加味左歸丸治療老年性癡呆(AD)患者20例，取得一定療效，并與用多奈哌齊片治療的20例進行對照，結果顯示二者療效無顯著差別。左歸丸具有滋陰補腎、填精益髓之效，切合 AD 腎精不足、腦髓失養、 神機失用的關鍵病機。陰虛乃衰老之本，據報道左歸丸治療老年癡呆等老年性疾病，收效顯著〔17，18〕。本研究AD細胞模型〔19〕的基礎上，應用左歸丸含藥血清干預AD細胞。結果顯示，與模型組較，左歸丸含藥血清對Aβ誘導的PC12細胞損傷有抑制作用，這與田旭升等〔20〕的研究一致。

細胞凋亡和自噬參與神經發育及神經系統對各種刺激的反應，細胞凋亡過多或自噬缺陷均與神經退行性變有關〔21〕。這兩個過程可能協同或拮抗作用，類固醇激素受體是細胞凋亡和自噬的調節因子，但它們在各種病理過程中的作用是復雜的。一般來說，雌激素、孕酮和礦物皮質激素受體介導抗凋亡信號，而雄激素和糖皮質激素受體(GR)參與促凋亡途徑〔22〕。研究表明，雌激素通過誘導海馬和皮層神經元信號通路聚集在線粒體上，通過維持鈣穩態、強化有氧糖酵解、持續和增強線粒體功能，促進有效的膽固醇轉運和β淀粉樣清除，對AD具有一定的治療意義〔23〕。本實驗結果表明，左歸丸有可能通過上調ER的表達抑制AD細胞的凋亡。

綜上，ER有可能是中醫學“腎腦相關”的通路之一。中醫學“腎通于腦”理論在現代醫學中可能與多種分子機制有關，還需進一步探索。