YAP抑制劑對慢性粒細胞白血病K562細胞增殖、凋亡的影響

盧洪飛 張敏鴻 楊建瓊 羅耀玲

(贛南醫學院第一附屬醫院 1檢驗科，江西 贛州 341000；2臨床醫學研究中心)

慢性粒細胞白血病(CML)是一種由費城染色體陽性的造血干細胞克隆擴增導致的骨髓增生性腫瘤，CML的發病機制與融合基因BCR-ABL1的表達有關，融合基因BCR-ABL1編碼是具有酪氨酸激酶(TK)活性的BCR-ABL蛋白，促進白血病細胞加重骨髓增生和抗凋亡〔1〕。由于白細胞增殖凋亡失衡、細胞分化失調，導致大量不成熟白細胞在骨髓內聚集，抑制骨髓的正常造血。目前，TK抑制劑(TKIs)作為CML治療的臨床一線用藥，顯著提高了患者生存率，但仍存在部分患者對TKIs耐藥或不耐受〔2〕。因此，尋找新的靶標基因是目前CML治療領域亟需解決的問題之一。

細胞的生長凋亡受細胞信號通路調控網絡的精密調節，腫瘤的發生及進展與多種信號通路異常失活密切相關。CML的發生及進展中Wnt、Notch、Hedgehog、Hippo信號通路等多條信號通路失調〔3,4〕。Hippo信號通路是一個協調正常細胞增殖、死亡和分化，調控組織生長的高度保守的生長控制信號通路，其失調與腫瘤的發生密切相關〔5〕，YAP是Hippo信號通路關鍵的轉錄調節因子，在多種腫瘤中異常表達。本研究擬分析YAP抑制劑維替泊芬通過抑制Hippo信號通路對CML細胞系K562細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要實驗儀器 CO2培養箱(Thermo、Forma 311)、潔凈工作臺(SW-CJ-2FD，上海博迅)、生物顯微鏡(Olympus，BX 41)、蛋白質電泳轉印系統(Bio-Rad，Mini-PROTEAN Tetra)、流式細胞儀(BD，FACSCalibur)、顆粒制冰機(三洋，SIM-F140)、低速冷凍離心機(中佳，KDC-2046)、連續光譜多功能酶標儀(Thermo Fisher，Varioskan Flash)、超純水儀(Millipore，RiOs5+Milli-Q Biocel)、萬向脫色搖床(北京六一，WD-9405B)等。

1.2主要實驗材料與試劑 K562細胞系(由贛南醫學第一附屬醫院臨床醫學研究中心保藏提供)；RPMI1640培養基及胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)；噻唑藍(MTT)粉劑(美國Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；Bax、Bcl2一抗(美國Abcam公司)；Western印跡相關試劑、β-actin一抗(上海碧云天公司)；維替泊芬(Selleck)等，所有化學試劑為分析純。

1.3細胞培養 取液氮貯存的K562細胞，37℃快速融化進行復蘇，含10% FBS的RPMI-1640培養基置于5%CO237℃培養箱中培養，顯微鏡下觀察細胞狀態，細胞生長至對數期時，1 000 r/min離心5 min離心傳代，進行后續實驗。

1.4MTT比色法測細胞增殖抑制率 取對數生長期細胞，細胞計數，調節細胞至合適濃度，接種4×103個細胞于96孔板；分為調零組、空白對照組、藥物處理組，各孔均重復3次，維替泊芬工作濃度依次為1、2、4、8、16 μmol/L，96孔中最終工作體積200 μl，二甲基亞砜(DMSO)含量不高于0.1%；細胞置于5%CO2、37℃培養箱中培養，分別于24、48、72 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，繼續培養4 h；1 000 r/min離心5 min，吸棄上清，每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解；酶標儀測量各孔OD 570 nm的吸光值。實驗重復3次，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/(對照組OD值-調零組OD值)×100%，根據GraphPad Prism6.0軟件計算維替泊芬作用K562細胞24 h半數抑制濃度(IC50)值，選擇合適濃度范圍用于后續實驗。

1.5AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞檢測法 1 000 r/min離心5 min收集4、8、16 μmol/L維替泊芬作用24 h后細胞；預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞，1 000 r/min離心5 min洗滌；加入300 μl 1倍結合緩沖液懸浮細胞；加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；加入5 μl PI染色后1 h內完成流式細胞儀上機檢測。Annexin V-FITC陽性細胞群為凋亡細胞，計算其占細胞總數比例，即為細胞凋亡率。重復3次實驗，統計分析。

1.6Western印跡 1 000 r/min離心5 min收集4、8、16 μmol/L維替泊芬處理24 h后的細胞，裂解細胞，提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)定量總蛋白濃度；12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每泳道上樣蛋白量為50 μg，80 V恒壓2 h；200 mA恒流濕轉1 h至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；室溫5%脫脂牛奶封閉30 min；4℃搖床孵育稀釋合適濃度的一抗過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；4℃搖床孵育稀釋合適濃度的對應二抗4 h；TBST洗膜3次，每次10 min；電化學發光(ECL)顯影，手動曝光，掃描膠片，Image J軟件分析目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值比值，計算相對表達量。實驗重復3次，統計分析。

1.7統計方法 使用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1MTT細胞增殖實驗結果 1、2、4、8、16 μmol/L維替泊芬濃度作用K562細胞24、48、72 h后，細胞增殖抑制率呈劑量及時間依賴性(P<0.05)，處理24 h時，IC50值為11.80 μmol/L，選擇4、8、16 μmol/L進行后續實驗，見表1。

2.2流式細胞檢測細胞凋亡結果 4、8、16 μmol/L維替泊芬作用K562細胞24 h后，單因素方差分析顯示組間比較差異顯著(F=59.09，P<0.05)。細胞凋亡率呈劑量依賴分別為(8.86±0.99)%、(16.54±0.45)%、(27.08±4.41)%，與對照組(3.49±0.61)%比較，K562細胞凋亡率在8、16 μmol/L維替泊芬作用24 h后差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

表1 不同濃度維替泊芬不同時間作用K562細胞的增殖抑制率

圖1 維替泊芬促進K562細胞凋亡

2.3Western印跡檢測細胞凋亡相關蛋白實驗結果 4、8、16 μmol/L維替泊芬作用K562細胞24 h后，促凋亡相關蛋白Bax表達隨維替泊芬濃度增加而升高，分別為對照組的1.14±0.08、1.28±0.06、1.74±0.11倍，單因素方差分析顯示組間比較差異有統計學意義(F=50.56，P<0.05)，8、16 μmol/L時與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；抑制凋亡相關蛋白Bcl-2表達隨維替泊芬濃度升高而降低，分別為對照組的0.75±0.09、0.54±0.07、0.36±0.08倍，單因素方差分析顯示組間比較差異顯著(F=47.11，P<0.05)，4、8、16 μmol/L時與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 維替泊芬對K562細胞凋亡相關蛋白的表達影響

3 討 論

維替泊芬是一種用作光動力療法的光敏劑藥物，于2000年被FDA批準用于治療年齡相關的黃斑變性〔6〕。研究表明，維替泊芬能夠抑制YAP-TEAD相互作用，抑制Hippo信號通路活性，抑制YAP誘導的肝臟過度生長〔7〕。Hippo信號通路是一條進化高度保守的信號通路，在哺乳動物中對調節組織內穩態、器官大小和腫瘤發生至關重要〔5〕。Hippo信號通路失調與多種腫瘤的發生發展密切相關，參與調節腫瘤細胞的生物學行為，如促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，細胞分化失調等，從而促進腫瘤發生發展〔8〕。YAP是Hippo信號通路的主要效應器之一，主要通過與TEAD家族轉錄因子相互作用發揮轉錄協同激活作用，促進下游靶基因的表達。研究表明，YAP在多種人類腫瘤中過度表達，并增加其核定位，包括結腸癌〔9〕、肺癌〔10〕、卵巢癌〔11〕、肝癌〔12〕、胃癌〔13〕等，表明YAP作為致癌基因，與多種腫瘤發生發展、侵襲遷移及不良預后相關。因此，特異性抑制YAP-TEAD相互作用，抑制YAP核蓄積，為抗癌治療提供新的分子靶點。

CML是一種造血干細胞克隆擴增導致的骨髓增生性腫瘤，目前，臨床主要采用TKIs靶向TK治療CML，但晚期CML、對TKIs耐藥、不敏感這部分患者仍然是治療CML急需解決的困難之一。近年國內外研究表明，Hippo信號通路異常激活與包括CML在內的白血病的發生發展有密切關系〔4,14,15〕，但Hippo信號通路在CML發生發展中的作用機制及YAP抑制劑維替泊芬對CML細胞生物學功能的作用文獻報道較少。本研究結果顯示維替泊芬作用K562可抑制其增殖，且呈時間及劑量依賴性，表明Hippo信號通路在K562細胞增殖中發揮重要作用，特異性抑制Hippo信號通路可抑制CML細胞K562增殖；流式檢測結果顯示維替泊芬作用K562促進細胞凋亡，且凋亡率隨濃度的增加而升高，Western印跡結果顯示維替泊芬作用K562細胞后，凋亡相關蛋白Bax表達上調，Bcl-2表達下調，其機制可能為維替泊芬抑制Hippo信號通路活性后，使得Bcl-2表達抑制，促進Bax表達，從而促進細胞凋亡，具體機制有待進一步研究。本研究表明，維替泊芬作用K562細胞，可抑制細胞增殖，促進凋亡，細胞增殖抑制可能與凋亡促進有關。

總之，Hippo信號通路在包括CML在內的多種惡性克隆性血液系統疾病中異常激活，與白血病的發生、發展及預后密切相關。在CML中Hippo信號通路異常激活，通過Hippo信號通路YAP抑制劑維替泊芬靶向抑制Hippo信號通路活性，可以抑制細胞增殖、凋亡，或許可為CML靶向治療補充思路。維替泊芬可特異性抑制YAP-TEAD相互作用，抑制Hippo信號通路，其或許可成為CML治療的一種老藥新用化療藥物。