敲減SATB1抑制結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲

陳超 馮長松 張偉麗 李先維

(信陽職業技術學院 1醫學院，河南 信陽 464000；2附屬醫院內科)

結腸癌是常見的惡性腫瘤，腫瘤細胞惡性表型與腫瘤細胞中相關基因的異常表達有關，研究腫瘤細胞惡性表型分子機制對于研究腫瘤發生機制和腫瘤的治療具有重要意義〔1〕。核基質結合區結合蛋白質(SATB)1在T細胞、前B細胞及神經和骨髓組織中表達水平較高，而在正常組織中的表達水平較低〔2〕。近年來的研究發現，SATB1與腫瘤的發生有關，其在乳腺癌、肺癌等腫瘤中異常高表達，并且在腫瘤的轉移中發揮促進作用〔3,4〕。在甲狀腺癌中發現敲低SATB1具有抑制腫瘤細胞侵襲的作用〔5〕。目前有研究已經發現SATB1在結腸癌中陽性表達率明顯高于癌旁組織，SATB1可能參與結腸癌細胞惡性增殖和轉移過程〔6〕。本實驗探討敲減SATB1對結腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等惡性生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 結腸癌SW480細胞購自南京科佰生物科技有限公司；陰性對照慢病毒和SATB1 shRNA重組慢病毒由南京雙領生物科技有限公司構建；Revert Aid第一鏈cDNA Synthesis試劑盒、Power SYBR Green PCR Master Mix購自美國Thermo；鈣黏附蛋白E(E-cadherin)抗體、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-9抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；基質金屬蛋白酶(MMP)-9抗體、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗體、MMP-2抗體購自美國Cell Signaling Technology；SATB1抗體購自美國Abcam。

1.2慢病毒感染和分組 SW480細胞分成3組，分別為：SW480-WT組、SW480-sh-NC組、SW480-sh-SATB1組，SW480-WT組為不感染慢病毒的野生型SW480細胞，SW480-sh-NC組、SW480-sh-SATB1組分別為感染陰性對照慢病毒和SATB1 shRNA重組慢病毒的SW480細胞。SW480細胞接種到6孔細胞培養板中，在倒置顯微鏡下觀察細胞密度為40%可以用于慢病毒感染，常規方法感染慢病毒，步驟為：把孔內的液體吸棄以后，添加MOI=20的慢病毒液，繼續放置在37℃，5% CO2培養箱中培養12 h以后，取出細胞培養板，更換細胞培養液，繼續培養3 d以后，用嘌呤霉素篩選穩定感染的細胞株用于后續實驗。

1.3Realtime PCR測定敲減效果 取融合率超過80%的SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞，用Trizol試劑提取細胞中的總RNA，吸取2 μl的RNA用紫外風光光度計檢測A260/A280的比值，其比值1.8～2.0可以用于實驗。根據Revert Aid第一鏈cDNA Synthesis試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，獲取的cDNA進行下一步的PCR擴增。引物設計如下：GAPDH正義鏈：5′-TGACTTCAACAGCGACACCA-3′,反義鏈5′-CACCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′,SATB1正義鏈：5′-CAGCACACCACCCAGCCGTC-3′,反義鏈：5′-GCTCGCACAACCATCCCTGGC-3′,引物交由上海生工合成。Power SYBR Green PCR Master Mix進行定量PCR，反應程序為：95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，30 s；共35個循環。采用2-△△Ct法計算SATB1 mRNA水平。

1.4Western印跡測定敲減效果 取生長至80%的SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌以后，添加蛋白裂解溶液，放在冰上裂解液30 min，期間每隔10 min混合一次。4℃，12 000 r/min離心10 min后，吸取蛋白上清溶液，添加到5×上樣緩沖液混合后，放在100℃煮沸5 min。按照常規方法配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，按照每個上樣孔中添加50 μg蛋白樣品上樣后，設置100 V電壓電泳，溴酚藍剛跑出凝膠以后停止電泳。在100 V電壓條件下把蛋白轉移到NC膜上，放在封閉液(以TBST配制5%牛血清白蛋白)中在室溫中孵育2 h后，將NC膜放在一抗和二抗反應液中，抗體反應液均以封閉液稀釋，一抗按照1∶800稀釋，二抗按照1∶2 000稀釋。電化學發光(ECL)以后，暗室中曝光，掃描圖片，用Image J分析條帶灰度值，設置GAPDH為參照。

1.5噻唑藍(MTT)方法測定結腸癌細胞增殖 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞接種到96孔細胞培養板中，每個孔中添加100 μl的細胞懸浮液，放在37℃，5%CO2培養箱中培養48 h以后，于每個孔內添加20 μl的MTT溶液，放在培養箱內繼續培養4 h。取出培養板，把孔內液體倒掉，添加DMSO溶液150 μl，置于酶標儀上測定490 nm的吸光度(A)值，以SW480-WT細胞存活率為100%，分析SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞存活率。

1.6平板克隆實驗測定結腸癌細胞克隆能力 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞按照每孔300個細胞接種到6孔板內，十字形晃動使細胞均勻分布，培養14 d以后，用甲醇固定，放在空氣中干燥，添加吉姆薩染色后，觀察細胞克隆形成數目，以克隆形成數目占接種細胞數目的百分比表示細胞克隆形成率。

1.7流式細胞術測定結腸癌細胞凋亡變化 取SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞各106個，用預冷的PBS將細胞洗滌3次以后，添加300 μl的結合緩沖液混合后，分別加入碘化丙啶(PI)和膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)染液混，上流式細胞儀檢測前添加200 μl的結合緩沖液。

1.8MTT方法測定結腸癌細胞黏附能力 將50 μg/ml的纖維黏連蛋白添加到96孔板中，每孔75 μl，用37℃預熱后的PBS洗滌以后，用牛血清白蛋白將非特異性位點封閉。將SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞接種到上述96孔板中，繼續培養2 h以后，用PBS把沒有黏附的細胞洗掉，添加100 μl的細胞液和20 μl的MTT溶液，孵育4 h后，吸除上清，繼續加入150 μl的DMSO溶液，置于酶標儀上測定490 nm的A值。以SW480-WT細胞黏附率為100%，分析SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞黏附率變化。

1.9細胞劃痕實驗測定結腸癌細胞遷徙運動能力 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞按照每孔中添加5×104個細胞接種到6孔板內，細胞至長滿時，用移液槍槍頭在培養板的中央劃出一條細痕，添加PBS洗滌以后，以不含血清的培養液繼續培養細胞，培養48 h后，取出培養板，用Image pro plus分析劃痕的寬度。劃痕愈合率=100%×(劃痕初始寬度-48 h劃痕寬度)÷劃痕初始寬度。

1.10Transwell小室測定結腸癌細胞遷移和侵襲能力 細胞侵襲和遷移實驗均用Transwell小室檢測，侵襲實驗前用50 mg/L的基質膠將小室濕化后進行實驗。步驟為：將 SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞以不含血清的培養液懸浮以后，細胞密度為1×105個/ml，各組細胞吸取200 μl添加到Transwell小室的上室中，在下室中添加500 μl的含有胎牛血清的細胞培養液，培養48 h以后，取出小室，用結晶紫染色以后，隨機選取5個視野，計數細胞穿膜數量。

1.11Western印跡檢測上皮間質轉化(EMT)標志蛋白E-cadherin、Vimentin和侵襲遷移蛋白MMP-2、MMP-9及凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達變化 取SW480-WT、SW480-sh-NC、SW480-sh-SATB1細胞，用Western印跡方法測定細胞中E-cadherin(抗體以1∶600稀釋)、Vimentin(抗體以1∶800稀釋)、MMP-2(抗體以1∶1 000稀釋)、MMP-9(抗體以1∶1 000稀釋)、Cleaved Caspase-3(抗體以1∶400稀釋)、Cleaved Caspase-9(抗體以1∶400稀釋)蛋白表達水平。

1.12統計分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析，LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1SATB1 shRNA下調結腸癌細胞中SATB1表達 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞中SATB1 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(均P<0.05)，見圖1，表1。

2.2敲減SATB1抑制結腸癌細胞增殖和克隆 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞存活率和克隆形成率均降低(P<0.05)，見圖2，表2。

圖1 Western 印跡檢測SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞中SATB1蛋白表達變

表1 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞中SATB1 mRNA和蛋白表達水平

圖2 平板克隆實驗檢測SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞克隆形成能力

表2 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞存活率和克隆形成率

2.3敲減SATB1誘導結腸癌細胞凋亡和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3，圖4，表3。

圖3 流式細胞術檢測敲減SATB1后SW480細胞凋亡變化

2.4敲減SATB1抑制結腸癌細胞遷徙運動和黏附 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞劃痕愈合率和細胞黏附率均顯著降低(P<0.05)，見表4。

圖4 Western 印跡檢測敲減SATB1后SW480細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達變化

表3 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平

2.5敲減SATB1抑制結腸癌細胞侵襲和遷移 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞侵襲數目、遷移數目和MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，見圖5，表5。

表4 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞劃痕愈合率和細胞黏附率

圖5 Western 印跡檢測SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達變化

表5 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞侵襲數目、遷移數目和MMP-2、MMP-9蛋白表達水平

2.6敲減SATB1抑制結腸癌細胞EMT 與SW480-sh-NC組比較，SW480-sh-SATB1組細胞E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，Vimentin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖6，表6。

圖6 Western 印跡檢測SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達變化

表6 SATB1 shRNA重組慢病毒感染后SW480細胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平

3 討 論

本實驗結果說明敲減SATB1能夠抑制結腸癌體外生長和轉移潛能的作用，SATB1可能在結腸癌發生和轉移中發揮促進作用，SATB1可能是一種癌基因。

SATB1能夠特異性識別核基質結合區域的作用，參與細胞內染色體高級結構的修飾過程，對于多個基因的轉錄過程具有調控作用，在細胞分化、凋亡、增殖等過程中具有重要作用〔7〕。近幾年來的研究報道顯示，SATB1與腫瘤的發生和轉移有關，其在腫瘤患者中高表達與預后、分期、浸潤具有相關性〔8〕。在乳腺癌中的研究報道顯示，SATB1通過調控下游基因的表達參與腫瘤血管形成、細胞黏附、增殖等過程〔9〕。還有報道表明，SATB1在肺癌細胞系中表達水平異常升高，并證實了SATB1是一個與肺癌轉移相關的調控因子，其可以通過激活下游信號增強肺癌轉移和惡性增殖能力〔3,10〕。在結腸癌中的研究表明，SATB1高表達與結直腸癌患者預后有關，SATB1在結腸癌轉移中發揮關鍵作用，SATB1具有抑制結直腸癌細胞生長、遷移的作用，并且SATB1在結直腸癌患者腫瘤組織的核和胞質中的活性高于未改變的結直腸癌患者黏膜，SATB1調控機制尚不清楚〔11～13〕。本實驗在體外結腸癌細胞中證實了SATB1在體外結腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移、黏附、運動等生物學作用中的調控作用，更為全面的說明了SATB1在結腸癌惡性發生過程中與在其他腫瘤中作用相同，均可能發揮促進作用。

腫瘤細胞的惡性生物學特性與細胞內的多種調控因子有關，細胞凋亡受到細胞內凋亡相關蛋白如Caspase的調控作用。目前已知Caspase-3是凋亡反應的下游因子，其被活化后形成Cleaved Caspase-3是細胞凋亡不可逆的標志，Caspase-9是凋亡反應的起始因子，其活化后形成Cleaved Caspase-9可以誘導Caspase凋亡反應發生〔14〕。在膀胱癌中發現SATB1基因沉默可以促進Caspase-3活化誘導細胞凋亡發生〔15〕。本實驗證實了下調SATB1具有誘導結腸癌細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達的作用，說明下調SATB1可能通過激活Caspase凋亡反應誘導細胞凋亡發生。

腫瘤的轉移是威脅腫瘤患者生命健康的重要原因，腫瘤細胞侵襲和遷移過程與細胞中MMP有關，MMP-2、MMP-9是兩個與腫瘤侵襲能力正相關的MMP成員，其可以將細胞外基質降解，促進腫瘤向遠端轉移〔16,17〕。在前列腺癌中已經證實SATB1表達水平與MMP-2呈正相關，下調SATB1抑制促卵泡素誘導的卵巢癌細胞侵襲過程的同時下調MMP-2表達〔18,19〕。腫瘤轉移的早期標志是腫瘤細胞EMT，EMT是廣泛存在于人體組織中的生理過程，其與胚胎發育、器官生長等有關〔20〕。EMT發生時細胞上皮標志物E-cadherin表達水平下降，而間質標志物Vimentin表達升高，E-cadherin和Vimentin表達變化是細胞EMT的標志〔21〕。本實驗在結腸癌中證實了下調SATB1可以降低細胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達，抑制Vimentin表達并促進E-cadherin表達，說明下調SATB1可以抑制結腸癌細胞EMT和基質金屬蛋白酶合成，這與其在腫瘤轉移中的研究報道相符合。

總之，下調SATB1具有抗結腸癌細胞轉移潛能的作用，其作用機制與抗Caspase凋亡反應及MMP表達有關，SATB1在結腸癌轉移和發展中可能發揮促進作用，靶向SATB1可能是治療結腸癌的有效途徑。目前對于SATB1的研究機制發現，SATB1是Wnt/β-catenin信號傳導的新靶點，SATB1高表達與β-連環蛋白異常表達，SATB1和β-連環蛋白與TCF7L2的啟動子和Wnt信號的下游靶點結合并調節它們的表達〔22,23〕。本實驗對于SATB1調控結腸癌轉移機制尚未研究，以后實驗中會探討SATB1與β-catenin信號轉導在結直腸癌中的調控機制。