長鏈非編碼RNA GAS5通過調控miR-196b-5p抑制非小細胞肺癌細胞增殖侵襲遷移的機制

劉向前 趙天增 楊金華

(南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院普胸外科，河南 南陽 473000)

肺癌是全世界人類最常見的一種癌癥，其中非小細胞肺癌(NSCLC)約占90%〔1,2〕。由于NSCLC的發病隱秘，臨床上大多確診患者已至晚期，已錯過最佳治療時期，其預后5年生存率不足16%〔3～5〕。目前靶向治療在很多癌癥中均為最有效的治療方法，因此尋找新的NSCLC分子治療靶標具有重要意義。長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一類轉錄長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA，其在NSCLC的診斷、治療中均具有重要作用〔6,7〕。LncRNA GAS5在NSCLC的研究中已證實為異常升高的致癌因子〔8,9〕，但其在NSCLC中具體的作用機制尚未十分清楚。miR-196b-5p在多種癌癥中均出現表達異常升高〔10～12〕，包括NSCLC，但其在NSCLC中的調控機制尚未完全清楚。

本研究將以NSCLC細胞A549為研究對象，檢測細胞中LncRNA GAS5和miR-196b-5p的表達，觀察過表達LncRNA GAS5、抑制miR-196b-5p、過表達miR-196b-5p對NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲的影響，揭示其機制可能與miR-196b-5p靶向負調控LncRNA GAS5有關，將為NSCLC的預防和治療提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 NSCLC細胞A549、肺支氣管正常細胞16HBE購自ATCC；DMEM培養基、胎牛血清、噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏公司；電化學發光(ECL)液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；Transwell小室、基質膠購自美國Coming公司；半干轉膜儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2細胞培養 采用含有10%胎牛血清的DMEM培養液培養NSCLC細胞A549、肺支氣管正常細胞16HBE，置于37℃,5% CO2的培養箱中常規培養。

1.3細胞轉染 將miR-196b-5p 模擬物(mimics)、miR-NC、miR-196b-5p 抑制劑(inhibitor)、anti-miR-NC、anti-miR-196b-5p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-GAS5按照LipofectamineTM2000脂質體說明書要求轉染至A549，分別標記為miR-196b-5p組、miR-NC組、miR-196b-5p inhibitor組、anti-miR-NC組、anti-miR-196b-5p組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-GAS5組；pcDNA3.1-GAS5分別與miR-NC、miR-196b-5p mimics用同樣的方法共轉染至A549細胞，標記為pcDNA3.1+miR-NC組、pcDNA3.1-GAS5+miR-196b-5p組，轉染24 h后，用qRT-PCR檢測。轉染成功后，用于后續實驗。

1.4qRT-PCR實驗 Trizol法提取組織樣本或對數生長期的細胞樣本總RNA,并進行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。按照逆轉錄試劑盒說明書要求進行操作，合成模板鏈cDNA。按照qRT-PCR試劑盒反應體系要求進行操作，反應結束后通過分析Ct值，計算定量結果，以2-△△Ct法計算miR-196b-5p的相對表達水平。每個樣品重復3次，取平均值。

1.5Western印跡實驗 RIPA蛋白裂解液對研磨組織或對數期細胞進行冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min。取上清置于無菌新EP管中，加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。然后離心，進行電泳，再用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜；5% 脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃室溫孵育2 h。加入發光液，曝光，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白GAS5的表達。

1.6MTT實驗 取適量1.3各組細胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培養3.5 h，然后棄去上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩，使結晶溶解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。細胞的增殖與吸光值呈正比。

1.7Transwell實驗 將1.3各組細胞以106個/孔接種于細胞6孔板，培養至融合度80%時，更換無血清培養基培養過夜。調整細胞密度至105個/ml，取100 μl加入上室內，600 μl含血清的培養基加入下室，培養過夜。取出小室，用棉簽擦去上室內的細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗滌。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細胞數，隨機選5個視野計數，取平均值。將Transwell小室上表面鋪適量厚度的基質膠，然后按照上述操作方法操作。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細胞。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測實驗 將熒光素酶報告載體(psiCHECK2-GAS5-WT，psiCHECK2-GAS5-MUT)分別與miR-196b-5p mimics、miR-NC用脂質體法轉染A549細胞，培養4 h后，更換新鮮培養液繼續培養，轉染48 h。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作步驟要求操作。結果以海參熒光素酶的發光強度與螢火蟲熒光素酶發光強度的比值反映miR-196b-5p與GAS5的結合力。

1.9統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1LncRNA GAS5和miR-196b-5p在A549細胞和16HBE細胞中的表達 A549細胞LncRNA GAS5的表達較16HBE細胞顯著降低(2.11±0.26 vs 4.36±0.41，P<0.05)，miR-196b-5p表達較16HBE細胞顯著升高(3.67±0.31 vs 1.06±0.16，P<0.05)。

2.2過表達GAS5對A549細胞增殖的影響 pcDNA3.1-GAS5組與pcDNA3.1組比較，GAS5表達顯著升高，在48、72 h時細胞活性顯著降低，均具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 過表達GAS5對A549細胞增殖的影響

2.3過表達GAS5對A549細胞遷移、侵襲的影響 pcDNA3.1-GAS5組與pcDNA3.1組比較細胞遷移及侵襲數顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 過表達GAS5對A549細胞遷移、侵襲的影響個)

2.4抑制miR-196b-5p對A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響 如表3所示，miR-196b-5p inhibitor組與miR-NC組比較細胞中miR-196b-5p表達顯著降低，在48、72 h時細胞活性顯著降低，細胞遷移量顯著降低，細胞侵襲量顯著降低(均P<0.05)。

2.5LncRNA GAS5調控miR-196b-5p的表達 通過Target scan對可能與miR-196b-5p結合的GAS5進行預測，發現miR-196b-5p與GAS5存在互補序列(圖1)。用雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞的熒光強度，與miR-NC組相比，miR-196b-5p 組WT-GAS5細胞的熒光活性顯著降低，MUT-GAS5細胞的熒光活性不受影響。見表4。

表3 抑制miR-196b-5p表達對A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響

圖1 LncRNA GAS5與miR-196b-5p的靶向關系預測

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.6過表達miR-196b-5p逆轉了GAS5對A549細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 如表5所示，pcDNA3.1-GAS5組與pcDNA3.1組比較miR-196b-5p表達顯著降低，在48、72 h時細胞活性顯著降低，細胞遷移及侵襲數顯著降低；pcDNA3.1-GAS5+miR-196b-5p組與pcDNA3.1-GAS5+miR-NC組比較miR-196b-5p表達顯著升高，在48、72 h時細胞活性顯著升高，細胞遷移及侵襲數顯著升高(P<0.05)。過表達miR-196b-5p逆轉了GAS5對A549細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

表5 過表達miR-196b-5p逆轉了過表達GAS5對A549細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

3 討 論

LncRNA具有組織特異性，且可以穩定存在于人的體液和組織中，這些優勢使其成為腫瘤診斷的生物標志物〔13,14〕。研究證實，LncRNA在NSCLC中的表達異常升高，如X染色體失活特異性轉錄本基因(XIST)、低氧誘導因子1α的反義核糖核酸(HIF1A-AS1)、肺癌轉移相關轉錄本(MALAT)1〔15,16〕。Liang等〔17〕對NSCLC患者手術前后血液中的GAS5進行檢測發現，NSCLC患者血液中GAS5的表達顯著降低，術后1 w患者血清中GAS5的水平顯著升高，提示GAS5可作為臨床診斷NSCLC的生物標志物。張學軍等〔18〕在NSCLC的研究中闡明，GAS5在NSCLC中低表達，且其表達量與NSCLC的惡性程度呈正相關，預示著LncRNA GAS5有望成為NSCLC的預后標志物。Tan等〔19〕用qRT-PCR檢測NSCLC組織和血液中GAS5的表達發現，NSCLC組織中GAS5明顯降低，術后急劇增加，推測GAS5可用于NSCLC的早期診斷和手術治療后的患者監測。本研究運用qRT-PCR檢測了NSCLC細胞A549中GAS5的表達發現，GAS5低表達，這與前人的研究結果均相一致；又用MTT實驗、Transwell實驗檢測了過表達GAS5的A549細胞的增殖遷移侵襲發現過表達GAS5可抑制A549細胞增殖、遷移、侵襲。

微小RNA(miRNA)被認為是基因表達的關鍵轉錄后調節因子，并且在各種癌癥中作為致癌基因或腫瘤抑制因子發揮關鍵作用〔20〕。Li等〔21〕通過qRT-PCR、蛋白免疫印跡分析在NSCLC中檢查miR-196b和GATA-6的表達，Transwell測定細胞的遷移和侵襲發現，miR-196b在NSCLC組織和細胞中均為高表達，且過表達miR-196b促進細胞遷移和侵襲，抑制miR-196b則表現出相反的效果，GATA6被證實是NSCLC細胞中miR-196b的特異性靶標，GATA6可減弱miR-196b調節的NSCLC細胞的遷移和侵襲，提示miR-196b通過下調GATA6增強NSCLC細胞的遷移和侵襲，表明miR-196b具有診斷和治療NSCLC的潛力。Yu等〔22〕在NSCLC的研究中發現，miR-196b的表達水平異常上調，且上調miR-196b可喪失細胞與細胞的接觸，刺激細胞侵襲和細胞形態變為紡錘體形狀，而同源框(HOX)A9在NSCLC中的表達與miR-196b呈負相關，且HOXA9為miR-196b的靶標，HOXA9可減弱鋅指2(SNAI2/SLUG)和基質金屬蛋白酶(MMP)9的表達，揭示了miR-196b可以作為開發抗癌劑的潛在靶標。本研究檢測了NSCLC細胞中miR-196b-5p的表達發現，miR-196b-5p在NSCLC細胞中高表達，且抑制miR-196b-5p可顯著降低A549細胞的增殖、遷移、侵襲，這與前人的研究結果相吻合；深入研究，用雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證了miR-196b-5p靶向負調控GAS5，且過表達miR-196b-5p可逆轉GAS5對A549細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

綜上所述，GAS5可抑制NSCLC細胞的增殖、遷移、侵襲，其機制可能與直接負向調控miR-196b-5p有關，為NSCLC的治療提供了新靶點。