基于共價有機框架的仿生光動力學(xué)治療試劑的構(gòu)建

葉佳琳 謝輝 黎婧怡 呂敏 陳楠

摘 ?要： 共價有機框架（COF）是一類新興的多孔有機聚合物，因其具有較大的比表面積、有序的孔道結(jié)構(gòu)以及良好的生物相容性，已成為具有潛力的納米藥物載體.制備了基于COF納米顆粒的仿生納米復(fù)合物，負載光敏劑孟加拉玫瑰紅（RB），并包裹癌細胞膜（CMV）對該復(fù)合物進行仿生修飾.結(jié)果表明：制備的COF/RB@CMV納米復(fù)合物具有良好的生物兼容性，能夠被腫瘤細胞有效攝取，并在光照激活條件下產(chǎn)生對細胞具有高毒性的活性氧化物（ROS），進而起到了殺傷腫瘤細胞的作用.提出了一種新的基于COF的仿生納米平臺用作光動力學(xué)治療（PDT）試劑.

關(guān)鍵詞： 共價有機骨架; 光動力學(xué)支療（PDT）法; 癌細胞膜（CMV）; 納米遞送

中圖分類號： ?Q 26 ? 文獻標志碼： A ? ?文章編號： 1000-5137（2021）06-0679-09

Abstract： Covalent organic frameworks （COF） are a new type of porous covalent organic structures that are potential candidates as nanocarriers due to their large specific surface area， ordered pore structure， and good biocompatibility. In the present work， a COF-based biomimetic nanocomposite was prepared. The photosensitizer Rose Bengal （RB） was loaded on the surface of COF， and cancer cell membrane（CMV） was coated to modify the nanoparticles. Our results showed that the synthesized COF/RB@CMV nanocomposite has good biocompatibility， can be efficiently uptaken by tumor cells， and produce highly toxic ralative oxygen species（ROS） under the light activation， which play a role in killing tumor cells. This study provides a new COF-based biomimetic nanoplatform for effective photodynamic therapy（PDT）.

Key words： covalent organic frameworks（COF）; photodynamic therapy（PDT）; cancer cell membrane（CMV）; nano-delivery

0 ?前 言

光動力治療（PDT）法被認為是當前癌癥治療最有前途的治療手段之一[1-2].PDT是通過特殊的光激活光敏劑（PS）產(chǎn)生對細胞有高毒性的活性氧化物（ROS）而達到殺傷腫瘤細胞的目的[3-4].孟加拉玫瑰紅（RB）是其中一種運用廣泛的光敏劑小分子，在560 nm光照條件下，RB發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的單線態(tài)氧（1O2）對細胞有高毒性，誘導(dǎo)細胞凋亡[5-6].但是作為親水小分子，RB的細胞攝取效果差，這極大限制了其在癌癥治療中的應(yīng)用，故需借助合適的載體增強RB的細胞攝取和生物相容性.基于納米級共價有機骨架（COF）展現(xiàn)了優(yōu)良的納米載體功能，本文作者試圖將RB結(jié)合于COF表面，形成納米復(fù)合物COF/RB，以實現(xiàn)RB的有效負載.

COF具有獨特的優(yōu)勢，如比表面積大、可調(diào)節(jié)的多孔結(jié)構(gòu)、高穩(wěn)定性、低毒性和良好的生物相容性等，在藥物運輸及PDT等研究領(lǐng)域引起了極大的關(guān)注[7-12].2018年，ZHANG等[13]合成了水分散性聚合物COF納米復(fù)合材料，提高了阿霉素（DOX）攝取，并實現(xiàn)DOX的可控釋放，高效殺滅體外腫瘤細胞.2019年，LIU等[14]將DOX成功載裝到COF中并應(yīng)用于活體腫瘤化學(xué)治療.近年來，COF尤其是納米級的COF已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最具潛力的納米載體[15-16].但是，在癌癥治療方面，COF納米負載系統(tǒng)的腫瘤細胞靶向問題仍是領(lǐng)域內(nèi)的難題.

近年來，覆蓋有活性細胞膜的仿生納米材料（NPs）在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受青睞[17-18].作為一種自上而下的方法，仿生NPs繞過了費力的表面修飾，保留了抗原和細胞膜結(jié)構(gòu)，可以發(fā)揮特殊功能，如配體識別和靶向，以及長期血液循環(huán)和免疫逃逸，為藥物遞送、排毒和疫苗接種提供了新的藥物納米平臺.癌細胞膜（CMV）擁有與膜蛋白的細胞間同源結(jié)合能力，可用于NPs表面功能化，以提供表面抗原多樣性完全復(fù)制的優(yōu)勢.ZHOU等[19]成功將負載DOX的納米材料包裹CMV，實現(xiàn)了對同源細胞的高度特異性識別.BALASUBRAMANIAN等[20]將CMV與納米材料結(jié)合，設(shè)計了一種新型的仿生納米反應(yīng)器應(yīng)用于細胞功能的研究.因此，CMV包被的NPs獲得同源的靶向作用非常適合靶向藥物遞送.

基于納米級COF的優(yōu)良的載體功能和CMV的高特異性靶向識別特性，制備了一種可應(yīng)用于PDT的腫瘤細胞膜包裹COF/RB納米復(fù)合物（COF/RB@CMV）.實驗結(jié)果表明：該復(fù)合材料具有良好的生物相容性，包膜材料能夠有效地被腫瘤細胞攝取;在560 nm光照下，COF/RB@CMV可以產(chǎn)生ROS，能高效殺傷腫瘤細胞.這種新型納米復(fù)合材料為解決腫瘤治療中藥物的水分散性差、靶向性弱等問題提供了新思路和新方法.

1 ?材料與方法

1.1 實驗材料

1，3，5-三（4-氨基苯基）苯（TAPB）和2，5-二甲氧基對苯甲醛（DMTP）購于吉林省延申科技有限公司;聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，相對分子量（Mw）為24 000）、乙酸（質(zhì)量分數(shù)為99.9%）、乙腈和苯甲醛購于麥克林試劑公司;最低必需培養(yǎng)基（MEM）、胎牛血清（FBS）、單線態(tài)氧綠色熒光探針（SOSG）購于Gibco Invitrogen;鈣黃綠素和碘化吡啶（Calcein-AM/PI）、藍色熒光染料（Hoechst 33342）購于碧云天公司;9，10-蒽二甲雙（亞甲基）二醛酸（ADMA）、孟加拉玫瑰紅（RB）購于Sigma-Aldrich（Shanghai）Trading Co.， Ltd.所有反應(yīng)物均按原樣使用，無進一步純化.超純水用Aquapro系統(tǒng)（18 MΩ·cm）制備.

1.2 儀器與設(shè)備

透射電子顯微鏡（TEM），JEOL 2100;場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FESEM），Hitachi S-4800;動態(tài)光散射分析儀，Malvern Nano-ZS90;紫外分光光度儀，Shimadzu UV-1800;X射線粉末衍射（XRD），Rigaku DMAX2000;超速離心機，Beckman Coulter DU 730;熒光分光光度儀，F(xiàn)-7000）;傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀，Nicolet iS5;動態(tài)光散射分析儀，Malvern Nano-ZS90;酶標儀，Thermo Multiskan MK3;560 nm發(fā)光二極管（LED）燈，PL-LED100F;激光共聚焦顯微鏡，Leica TCS SP8.

1.3 實驗步驟

1.3.1 COF的合成

1，3，5-三（4-氨基苯基）苯（49.2 mg，0.14 mmol），2，5-二甲氧基對甲醛（42.7 mg，0.22 mmol），PVP（Mw為2.4 w，50 mg），冰醋酸的混合物（2.5 mL）和乙腈（50 mL）在25 ℃下攪拌12 h.然后，將苯甲醛（2 μL，0.4 mmol）添加至反應(yīng)系統(tǒng)以淬滅反應(yīng).1 h后，通過離心分離顆粒，并用乙腈洗滌3次，得到黃色粉末狀COF.產(chǎn)量：70 mg，所得COF用于后續(xù)表征和生物實驗.

1.3.2 HeLa細胞培養(yǎng)

HeLa細胞在體積分數(shù)為10 % FBS、100 units·mL-1青霉素、100 units·mL-1鏈霉素和2 mol·L-1 L-glutamine的MEM中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，體積分數(shù)為5% CO2環(huán)境培養(yǎng).

1.3.3 HeLa細胞膜的提取

HeLa細胞懸浮在低滲裂解液中（20 mmol·L-1 Tris-HCl，0.5 mmol·L-1 MgCl2，75 mmol·L-1蔗糖，蛋白酶抑制劑混合物，pH=7.4），冰浴超聲處理.然后，低溫（轉(zhuǎn)速20 000 r·min-1，4 ℃，10 min）離心除去完整的細胞和分裂的核;上清液在低溫（轉(zhuǎn)速100 000 r·min-1，4 ℃，1 h）下超速離心，獲得癌細胞膜沉淀物.膜儲存在-80 ℃下備用.

1.3.4 COF/RB@CMV的制備

將上述制備的COF分散在超純水中，制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的COF懸液.過量的RB與COF在轉(zhuǎn)速為300 r·min-1的混勻儀上室溫攪拌2 h.然后，用超純水離心洗滌3次得到COF/RB復(fù)合物.超聲處理5 min已經(jīng)獲得的細胞膜囊泡，然后將細胞膜囊泡與COF/RB在4 ℃孵育8 h，獲得細胞膜囊泡包裹的納米粒子，即COF/RB@CMV分散體.

1.3.5 COF及COF/RB@CMV的表征

用FESEM和TEM來表征COF和COF/RB@CMV的形貌及粒徑;用動態(tài)光散射分析儀來表征水分散性和Zeta電位;XRD圖可表征COF的晶體結(jié)構(gòu);利用FT-IR可分析COF的表面功能基團.

1.3.6 體外表征1O2

1.3.6.1 SOSG檢測1O2

SOSG用來檢測ROS的生成.10 μL的SOSG（500 μmol·L-1，二甲基亞砜（DMSO））添加到990 μL的含有1 μg COF/RB的工作液中，使用LED燈（（560±10） nm，200 mW·cm-2）照射不同時間（0，2，4，6，8和10 min）后，測量該溶液在530 nm處的熒光.

1.3.6.2 ADMA檢測1O2

10 μL的ADMA（500 μmol·L-1，DMSO）添加到990 μL的含有1 μg COF/RB的工作液中，使用LED燈輻照（（560±10） nm，200 mW·cm-2）不同時間（0，2，4，6，8，10，20和30 min）后， 紫外分光光度儀測試該溶液在259 nm下的吸光度.

1.3.7 細胞攝取

在直徑為35 mm的玻璃底培養(yǎng)皿中接種5×104 HeLa細胞，培養(yǎng)24 h后，加入COF/RB@CMV孵育8 h.到達時間點后用PBS漂洗3次，使用5 μg·mL-1 Hoechst染細胞核8 min，PBS漂洗3次，激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察材料的細胞攝取量.

1.3.8 細胞計數(shù)試劑（CCK-8）測試細胞毒性實驗

細胞以8×103細胞每孔的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h;隨后，將不同質(zhì)量濃度的COF/RB或COF/RB@CMV（0～200 μg·mL-1）與細胞在37 ℃下共孵育24 h，在每個孔中加入CCK-8，37 ℃孵育30 min;然后使用酶標儀測定450 nm處吸光度值.

1.3.9 活性氧熒光探針（DCFH-DA）檢測細胞內(nèi)ROS

以DCFH-DA作為ROS指示劑，用CLSM成像來評估細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生.將HeLa細胞（3×104）接種在小皿中并培養(yǎng)24 h.然后，將細胞與2 μg·mL-1的COF/RB或COF/RB@CMV孵育4 h.用PBS洗滌后，將細胞樣品用LED陣列（（560±10） nm，200 mW·cm-2）照射5 min，用冷PBS洗滌2次，接著添加DCFH-DA溶液（1×10-6 mol·L-1），并將該溶液與細胞孵育15 min.使用CLSM（488 nm）進行成像，根據(jù)熒光強弱來評估ROS的產(chǎn)生量.

1.3.10 Clalcein-AM/PI評估材料的殺傷作用

使用Calcein-AM/PI細胞凋亡檢測試劑盒分析細胞凋亡情況.將細胞接種在小皿中并孵育24 h，用相同質(zhì)量濃度（2 μg·mL-1）的COF/RB或者COF/RB@CMV處理4 h.然后，將細胞樣品用LED陣列（（560±10） nm，200 mW·cm-2）照射5 min，用冷PBS洗滌2次，向其中加入Calcein-AM/PI（其中Calcein-AM為2 μmol·L-1，PI為4.5 μmol·L-1），室溫、黑暗中孵育20 min，CLSM對其進行熒光成像.

2 ?結(jié)果與討論

2.1 COF的合成和表征

根據(jù)文獻報道，用1，3，5-三（4-氨基苯基）苯、2，5-二甲氧基對甲醛、PVP、冰醋酸的混合物和乙腈在較為溫和的條件下成功制備了一種亞酰胺類COF[21-22].TEM和FESEM表征合成的COF，結(jié)果如圖1（a）和圖1（b）所示，COF呈花球狀，其粒徑均一，大小為200 nm左右，且分散性較好.COF NPs的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)，圖1（c）所示，XRD圖表明，COF NPs具有較好的結(jié)晶度，其特征峰（2θ=2.74°）與文獻報道的高度吻合，表明COF NPs的成功制備.FT-IR對COF NPs及其制備原料（DMTP，TAPB）進行了光譜學(xué)表征.如圖1（d）所示，在3 451，1 680和3 337 cm-1處的峰值分別屬于DMTP中-OH，C=O和C-O鍵的伸縮振動特征峰.在3 436 cm-1和3 352 cm-1處出現(xiàn)了明顯的N-H鍵的伸縮振動峰，屬于TAPB配體中所帶的氨基基團.在1 617 cm-1處出現(xiàn)了典型的C=N鍵的吸收振動峰，表明COF NPs是由DMTP與TAPB中所帶的醛基和氨基之間通過席夫堿反應(yīng)連接而形成的.綜上所述，所有表征結(jié)果表明COF NPs的成功合成.

2.2 COF/RB@CMV的表征

通過π-π堆積等相互作用力，光動力學(xué)治療（PDT）的RB被吸附在COF表面，形成COF/RB納米復(fù)合物，紫外吸收光譜如圖2（a）所示，修飾過的COF/RB的紫外吸收比COF在560 nm左右處多了一個吸收峰，證明COF上成功負載了光敏劑RB.為了進一步證明RB的成功負載，檢測了COF，RB和COF/RB復(fù)合物的紅外振動峰位置，如圖2（b）所示，COF/RB復(fù)合物明顯多了光敏劑的特征振動峰位置（2 900 cm-1），與之前紫外吸收光譜圖相符.

圖2（c）的TEM圖顯示，COF/RB@CMV直徑在200 nm左右，與圖1（a）相比，COF/RB@CMV材料上明顯有一層膜結(jié)構(gòu)，說明癌細胞膜成功包裹COF/RB. Zeta電位圖證明負載帶負電的RB后COF電位變得更負，如圖2（d）所示，COF/RB@CMV的電位到-40 mV，此結(jié)果與文獻報道一致.因此判斷，COF/RB@CMV成功制備.

2.3 COF/RB和COF/RB@CMV的細胞攝取

納米粒子是否具有良好的生物相容性是其能否應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)的重要因素.因此，本文作者考察了納米粒子COF/RB的生物相容性.CCK-8被用來評估材料的細胞毒性，結(jié)果如圖3（a）所示，在沒有光照的條件下，材料孵育質(zhì)量濃度增加至200 μg·mL-1，細胞存活率仍維持在100%左右.這實驗表明，COF/RB和COF/RB@CMV都有很好的生物相容性.

進一步探究材料的細胞攝取情況.由于RB在545 nm處有吸收，因此可通過細胞內(nèi)RB的綠色熒光信號來判斷COF/RB和COF/RB@CMV的細胞攝取情況.HeLa細胞與質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1 COF/RB和COF/RB@CMV分別孵育8 h后，COF/RB組只有微弱的綠色熒光信號，而COF/RB@CMV組有很強的綠色熒光信號，證明材料能夠被HeLa細胞攝取，同時說明癌細胞膜包裹的納米材料能夠提高細胞攝取效率，如圖3（b）所示.這為構(gòu)建用于生物醫(yī)學(xué)的仿生低劑量納米材料建立了基礎(chǔ).

2.4 1O2的檢測

前期已有研究證明RB在光照條件下可產(chǎn)生ROS，故接下來探究合成的COF/RB產(chǎn)生ROS的能力.使用ADMA和SOSG兩種單線態(tài)氧探針分別評估COF/RB產(chǎn)生1O2的能力.

ADMA探針本身在光照下不會發(fā)生光降解，而1O2卻可以誘導(dǎo)ADMA發(fā)生光降解.如圖4（a）所示，在光照條件下（（560±10） nm，200 mW·cm-2），ADMA探針在259 nm處的吸收隨著光照時間的增加而降低，表明AMDA探針被1O2降解，并且AMDA探針的吸收與光照時間呈負相關(guān)，即1O2的產(chǎn)生與光照時間正相關(guān).

SOSG對于1O2具有高度選擇性，與其他熒光或者化學(xué)發(fā)光單線態(tài)氧檢測試劑不同，它對氫氧自由基（·OH）和超氧離子自由基（·O2-）無任何明顯的響應(yīng).圖4（b）可以看出SOSG隨著光照時間的增加，熒光也在增強，證實COF/RB產(chǎn)生了具有癌細胞殺傷力的單線態(tài)氧，且1O2生成與光照時間成正相關(guān)，進一步證實ADMA的測試結(jié)果.

為了驗證COF材料在癌細胞內(nèi)是否依然產(chǎn)生ROS和具有PDT效果，研究熒光探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生.當有ROS存在時，無熒光的DCFH可被氧化成有綠色熒光的2'，7'-二氯熒光素（DCF）.圖4（c）的細胞內(nèi)單線態(tài)氧熒光成像圖（λ=525 nm）可以看出，與空白對照相比較，COF/RB處理后的HeLa細胞內(nèi)只有微弱的綠色熒光信號，而COF/RB@CMV處理的細胞可以看到較強的綠色熒光信號，這說明HeLa細胞對COF/RB@CMV的攝取增多，有力地證明癌細胞膜的包裹增加了材料的靶向性.

2.5 COF/RB@CMV對細胞具有明顯的殺傷作用

以上實驗結(jié)果表明相同濃度的COF/RB@CMV比COF/RB能夠產(chǎn)生更多ROS，為了直觀地展示COF/RB@CMV的殺傷效果，使用Calcein-AM和PI雙染檢測了腫瘤細胞的死亡情況.如圖5所示，HeLa細胞分別與相同質(zhì)量濃度（20 μg·mL-1）COF/RB@CMV和COF/RB孵育4 h，并加以光照30 min，COF/RB@CMV組幾乎所有的細胞都呈現(xiàn)紅色，而COF/RB孵育的細胞呈現(xiàn)紅色的比例明顯低于COF/RB@CMV.實驗現(xiàn)象表明：COF/RB@CMV在相同濃度和光照的條件下可以更好地殺傷靶細胞，證明了仿生納米材料在生物醫(yī)學(xué)方面具有較大的應(yīng)用價值和潛力.

3 ?結(jié) 論

本工作采取較為溫和的方法，成功制備出一種亞酰胺類的COF，并以COF為載體成功合成了可應(yīng)用于PDT的腫瘤細胞膜包裹的COF/RB納米復(fù)合材料COF/RB@CMV.該復(fù)合材料具有良好的生物相容性，能夠有效地被腫瘤細胞攝取，并在細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，可殺傷腫瘤細胞，實現(xiàn)PDT.本研究為解決基于COF納米負載系統(tǒng)的靶向性問題提供了發(fā)展方向，同時為COF在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用提供了理論指導(dǎo).

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（責任編輯：郁慧，馮珍珍）