基因檢測技術(shù)應(yīng)用于溺死診斷的研究進展

劉泉，柯技，王樹法

（湖北警官學院，湖北 武漢）

0 引言

判斷水中尸體是生前溺死還是死后拋尸是法醫(yī)學實踐中是常見的工作之一。目前，診斷溺死的常用方法是在觀察尸體征象的基礎(chǔ)上，結(jié)合光鏡下檢驗硅藻。傳統(tǒng)光鏡下檢驗硅藻存在檢材消耗量大、實驗過程安全性不高、實驗過程損耗高、污染系數(shù)高等問題，常被法醫(yī)工作者詬病。隨著分子生物學的發(fā)展，基因檢測技術(shù)相較于光鏡下檢驗硅藻有取材用量少、一次性檢驗樣本多、易于浮游生物種屬分類、實驗過程安全等優(yōu)勢，為輔助溺死診斷提供了新的研究方向。本文將對相關(guān)研究現(xiàn)狀作綜述，以供同行參考。

1 基因檢測技術(shù)用于藻類檢驗

使用基因檢測技術(shù)檢驗藻類的某些特有基因片段，不僅可用于硅藻檢驗，還可用于其他傳統(tǒng)方法不易辨認的藻類的檢驗，甚至可進行溺死地點的推斷[1]，從而為輔助溺死診斷提供更多證據(jù)。

1.1 檢測藻類核基因

目前，藻類核基因中研究最多的是核糖體基因，即編碼rRNA 相對應(yīng)的染色體上的DNA 序列，簡稱rRNA 基因或rDNA。根據(jù)rRNA 的沉降系數(shù)，原核生物的rRNA 分為5SrRNA、16SrRNA 和23SrRNA；真核生物的rRNA 分為5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA 和28SrRNA，它們之間被轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）間隔開。

其中，16S rDNA（真核為18S rDNA）片段長度在1500 bp 左右，廣泛存在于浮游生物的染色體中，也是通常所說的小核糖體亞基（SSU）[2]，其序列相對保守，有9 個可變區(qū)域，可為種屬鑒別提供豐富的信息，因此是應(yīng)用非常廣泛的理想檢測標記之一。Tie 等人[3]對溺死者組織進行PCR后檢測，發(fā)現(xiàn)藍藻的16S rDNA 片段用于溺死診斷的靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的硅藻檢驗法，為除硅藻外的其他藻類輔助診斷溺死提供了依據(jù)。何方剛等人[4-5]研究表明使用PCR 技術(shù)擴增浮游生物16SrDNA 第三、第四可變區(qū)可用于溺死的定性診斷，使用PCR-DGGE 法擴增檢測相應(yīng)基因片段還可用于溺死地點的推斷。為克服不能同時擴增多種與溺死相關(guān)藻類，李鵬等人[6]設(shè)計出針對多種藻類16S rDNA 片段的特異性引物，發(fā)現(xiàn)該方法有較好的應(yīng)用前景。

由于應(yīng)用硅藻診斷溺死較為成熟，有許多研究僅關(guān)注基因檢驗技術(shù)用于硅藻的檢測。周玉倩[7]以硅藻特異的18S rRNA 基因片段為對象，比較了PCR 和PCR-DGGE，發(fā)現(xiàn)用PCR 技術(shù)擴增硅藻18S rDNA 基因片段診斷溺死的靈敏度和特異性優(yōu)于傳統(tǒng)的硅藻強酸消化法，但PCR-DGGE 得到的條帶卻不明顯，分析可能是因為前期擴增產(chǎn)物量較低的原因。胡蝶等人[8]使用PCR 技術(shù)構(gòu)建了硅藻18S rDNA 克隆文庫，為使用硅藻18S rDNA 推斷溺死地點提供了更多信息。余政梁等人[9]采用PCR-DHPLC 法檢測硅藻的SSU 片段，結(jié)果顯示該方法檢出的硅藻種類明顯多于微波消解掃描電鏡法，可為溺死診斷和溺死地點的推斷提供更多的信息。使用硅藻進行溺死地點的推斷還可選用5.8S+ITS2 片段，該片段長度在300～400 bp，有高度的特異性，被認為是區(qū)分不同硅藻物種的最可靠的標記[10]。袁文勇等人[11]針對硅藻的5.8S+ITS2 分子標記，使用PCR-CE 法對2 個案例進行研究，發(fā)現(xiàn)該遺傳標記也可用于溺水及溺水地點的診斷。

1.2 檢測藻類葉綠體基因

一般來說，任意兩種植物的葉綠體基因同源性不少于30%，因此檢測葉綠體基因也可以對藻類進行分類。目前，有用于溺死研究的藻類葉綠體基因有核酮糖-1,5-二磷酸羧化/ 加氧酶人亞基基因（rbcL）、葉綠體23SrDNA 基因的V結(jié)構(gòu)域（UPA）、葉綠素a 脫輔基蛋白基因（EG）和藻黃素-葉綠素a/c 蛋白基因（SK）等。

EG 片段長度在200 bp 左右，SK 片段長度在250 bp 左右，均是廣泛分布在各個水域中藻類的葉綠素相關(guān)基因。Abe 等人[12]使用PCR 方法擴增EG（EG1、EG2）和SK（SK1 和SK2），發(fā)現(xiàn)EG 相較于SK 能檢測更多種硅藻，用來溺死診斷的實用價值更大。李小廷等人[13]的研究也證實了該方法的陽性檢出率高于硝酸消化法，但也發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR 技術(shù)檢測EG 和SK，目前無法進一步進行種屬分類用于溺死地點的推斷。UPA 片段約長370bp，主要集中在紅藻的研究中，研究表明其具有較高的通用性和分辨力，能在種的水平上，把大多數(shù)的紅藻物種區(qū)分開來[14]，具有用于溺死地點推斷的潛力。劉向東等人[15]建立了針對硅藻UPA 條形碼基因的qPCR 檢測方法，對28例溺死和4例非溺死者的肺、肝、腎以及尸體發(fā)現(xiàn)地水樣進行檢測，發(fā)現(xiàn)其不僅適用于溺死案件的輔助診斷，而且靈敏度顯著高于傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)。rbcL 基因長度約為1400bp，其rbcL-3′端擴增測序效率極高，出現(xiàn)內(nèi)含子的概率較小，適于硅藻的分類。彭帆等人[16]建立了溺死尸體組織內(nèi)硅藻rbcL 基因的PCR-CE 檢測方法，發(fā)現(xiàn)當溺死尸體組織樣本中硅藻含量＞10 個/10 g 時，該方法的檢出率與微波消解-真空抽濾-自動掃描電鏡法（MD-VFAuto SEM）相比無統(tǒng)計學差異；當硅藻含量＜10 個/10 g 時，該方法的檢出率顯著小于MD-VF-Auto SEM 法。

1.3 檢測藻類線粒體基因

藻類線粒體基因一般分為兩類：一是與呼吸作用有關(guān)的基因，如細胞色素基因、細胞色素氧化酶基因、ATP 合成酶基因及琥珀酸脫氫酶基因等；二是與轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)的基因，如包括tRNA、rRNA 等。

目前，藻類中研究較多的是細胞色素C 氧化酶基因（COX-Ⅰ），COX-Ⅰ上有長度為500bp 左右的片段，能進行多種藻類的區(qū)分[17-18]。Evans 等人[19]研究發(fā)現(xiàn)，該基因可用于硅藻門下22 多個屬進行再分類，說明其具有成為硅藻條形碼標記的潛力。鄧建強等人[20]使用硅藻COX-Ⅰ基因中具有高效特異性的引物KEint2F 和KEintR 進行PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)該法比傳統(tǒng)消化鏡檢具有更高的硅藻檢出率，可用于法醫(yī)學溺死的診斷，但尚無法進行落水地點的推斷。

2 基因檢測技術(shù)用于細菌檢驗

自然界水域中，還存在各種細菌。由于水中硅藻體積形狀差異較大，大小在2～200 μm，部分硅藻不易通過氣血屏障進入血液循環(huán)，從而降低體內(nèi)硅藻的檢出率。水中細菌大小在0.2～2 μm，普遍比硅藻體積更小，因此被認為有潛力成為溺死診斷的另一個理想標記物[21]。

2.1 檢測低鹽濃度水域中細菌的相關(guān)基因

低鹽濃度水域一般為江河湖等淡水水域。由于淡水與海水中的環(huán)境不一樣，因此這兩類水域中生存的細菌種類會有所差別。通過檢測溺死者體內(nèi)不同類型的細菌，可用于溺死的診斷及溺死地點的推斷[22-23]。低鹽濃度水域中，目前研究的較多的為氣單胞菌屬相關(guān)基因，如氣溶素基因（aerA）、促旋酶B 亞單位基因（gyrB）、溶血素基因（hlyA）和16SrRNA基因等。

areA 基因長度約1400 bp，具有種屬特異性，基因序列同源性較高[24]。hlyA 基因長度約1900bp，普遍存在于臨床和環(huán)境中嗜水氣單胞菌中，且與areA 基因同源性僅有46.70%[25-26]。16SrRNA 基因約1500bp，是細菌分類及多樣性研究的重要分子標記。gyrB 基因長度約2400 bp，廣泛存在于各種細菌中，含有可變區(qū)和保守區(qū)，特別適用于菌株的區(qū)別和鑒定。Aoyagi 等人[22]使用巢式PCR 對32 份心血樣本中氣單胞菌的進行PCR 檢驗，27 個案件中均擴增出氣單胞菌基因組中氣單胞菌溶血素基因，認為擴增該基因可用于溺死的診斷。Guy 等人[27]使用qPCR 法擴增20例溺水者體內(nèi)氣單胞菌的aerA、gyrB 基因，結(jié)果顯示該方法可以用來推斷死者是否為淡水中溺死。朱曉琳[28]將氣單胞菌的hly A、aer A、16SrRNA 基因與硅藻的多個基因作為共同的研究對象，構(gòu)建了浮游生物相關(guān)基因座的復(fù)合擴增檢測體系，認為采用該方法相較于單一基因的檢測具有特異性強、耗時短、通量大和操作便捷等優(yōu)點，具有良好地應(yīng)用前景。麥柏盛等人[29]建立了嗜水氣單胞菌gyrB 和16SrRNA 基因PCR 毛細管電泳檢測方法，發(fā)現(xiàn)該方法檢測嗜水氣單胞菌gyrB 基因用于診斷淡水溺死靈敏度較高，可作為診斷的輔助性方法；聯(lián)用16SrRNA 基因可提高該菌的檢出率。

2.2 檢測高鹽濃度水域中細菌的相關(guān)基因

高鹽濃度水域一般為海水。高鹽濃度水域中與溺死有關(guān)的基因研究較少，曾報道過有用于溺死診斷的基因有弧菌屬的過氧化氫酶基因（katA）、跨膜轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因（toxR）和溶血素基因（vhh）；還有桿菌屬的尿素酶基因（ureC）、超氧化物歧化酶基因（sodB）和熒光素酶A 基因（luxA）等。這些基因普遍存在所述菌屬中，片段長度在不同類型的弧菌或桿菌長度有所不同，但均具有一定的保守性，可用于相關(guān)菌屬的鑒定[30-35]。Uchiyama 等人[23]選取了上述基因用qPCR 技術(shù)進行檢測，發(fā)現(xiàn)淡水水域中死者肺部均檢測出氣單胞菌，未檢出弧菌和桿菌；海水水域中死者肺部均檢測出弧菌和桿菌，其中45%死者肺部同時還檢測出氣單胞菌，推測可能是由于該微生物存在于從河流流向海水的水域中。不僅如此，整個實驗血液和內(nèi)臟器官檢測陽性率明顯高于常規(guī)硅藻檢驗，可進行死亡地點的判斷。

2.3 檢測人體環(huán)境中細菌的相關(guān)基因

在浴池或浴缸內(nèi)的水由于是被處理過的，各種自然水域中常見的藻類和細菌均相對稀少，從而很難通過傳統(tǒng)微生物檢驗來診斷溺死。目前報道過可用來浴池或浴缸水域中溺死診斷的為果糖基轉(zhuǎn)移酶（FTF）基因。

FTF 主要是位于口腔中唾液鏈球菌、變異鏈球菌分泌，在溺水時會隨著溺液進入體內(nèi)。這兩種菌屬的FTF 基因長度分別約為1400 bp、4000 bp，有兩個高度保守區(qū)，可用于鏈球菌的鑒定[36-37]。Suto M 等人[38]通過對唾液鏈球菌的果糖轉(zhuǎn)移酶（FTF）基因進行PCR 擴增發(fā)現(xiàn)在溺死者的血液與內(nèi)臟器官中均能檢測出陽性，而溺液中卻檢測不出，這為溺死在不含浮游生物的水中的案例提供了有用的參考。

除了可通過基因檢測技術(shù)檢測人體喉部、口腔唾液中的正常菌群外，還有人嘗試使用細菌培養(yǎng)的方式檢測存在人體中的致病菌，如細菌糞大腸菌、糞鏈球菌等是否能成為溺死診斷的標志[39]，但相關(guān)的基因檢測研究還未見。

3 基因檢測技術(shù)用于人體基因的檢測

在溺水過程中，大多數(shù)溺水者的肺部會有溺液進入從而引起窒息，這是典型溺死。有的被證實為溺死的案件在肺部未發(fā)現(xiàn)溺液，這是非典型溺死。無論哪種過程，人體都會受到損傷，在基因轉(zhuǎn)錄或表達水平上發(fā)生一定變化，檢測某些特有基因的轉(zhuǎn)錄和表達水平，可為輔助診斷溺死提供新的視角。信使RNA（mRNA）是由DNA 的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來的、攜帶遺傳信息的能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類單鏈核糖核酸，長度一般比對應(yīng)的基因片段要短，檢測相應(yīng)mRNA 的數(shù)量變化，可推斷相關(guān)人體基因的表達變化。

趙兵等人[40]用qPCR 法檢測雄性Wistar 大鼠肺組織AQP-1、AQP-4 mRNA 的表達水平，發(fā)溺死組相關(guān)基因表達水平明顯高于拋尸入水組，認為該基因表達水平的檢測可能對生前溺死與死后拋尸的鑒別有一定意義。王莉曉等[41]采集SD 大鼠的肺組織，并使用qPCR 檢測CCL2、CCL7 和CCR2 的mRNA 的表達水平，發(fā)現(xiàn)淡水溺死組CCL2 和CCL7的mRNA 的表達水平顯著高于淡水應(yīng)激組，但與疾病對照組比較，無統(tǒng)計學差異，認為該方法對溺死的診斷有一定的輔助作用。姜美玲等人[42]用qPCR 法檢測大鼠肺組織及右心室血清的IL-1α、IL-1β 和IL-13 的mRNA 的表達情況，發(fā)現(xiàn)與空白對照組及心肌梗死組比較，溺死組大鼠右心室血清中的IL-1β、IL-13 的 mRNA 表達顯著升高，說明細胞因子IL-1β 及IL-13 的mRNA 的表達與溺死密切相關(guān)。

特異性應(yīng)激基因或損傷修復(fù)的轉(zhuǎn)錄或表達水平的檢測，不僅可輔助診斷溺死，還可為非典型溺死與典型溺死的鑒別診斷提供依據(jù)。如尹長玉[43]使用qPCR 技術(shù)檢測溺死大鼠肺組織內(nèi)88 種應(yīng)激相關(guān)基因的差異表達，發(fā)現(xiàn)非典型溺死組與典型溺死組表達有顯著性差異的基因有13 種，這說明非典型溺死與典型溺死兩種死亡過程有不同的應(yīng)激反應(yīng)機制，其中以CCL2 為代表的CCL 家族基因和IL 家族基因是鑒別非典型溺死的有效生物標志物。

4 總結(jié)

從相關(guān)研究的基因片段來看，以上基因片段基本都可輔助溺死的定性診斷，靈敏度普遍高于傳統(tǒng)的酸消化法。適用于溺死地點推斷的基因有藻類的16S rDNA（真核為18S rDNA）、硅藻的5.8S+ITS2 分子標記和細菌的基因。其中16S rDNA（真核為18S rDNA）用于溺死推斷需要使用對不同核酸片段區(qū)別度更高的基因檢測技術(shù)，而硅藻的5.8S+ITS2 分子標記僅用法醫(yī)工作者常用的PCR-CE 法即可；細菌的基因只能用來進行大區(qū)域的溺死地點推斷，無法進行某單一水域中更具體地點的推斷。rbcL、EG 和COX-Ⅰ能對硅藻進行再分類，UPA 能對紅藻在種的平面上進行再分類，有用來進行溺死地點推斷的潛力。

從相關(guān)研究使用的檢測技術(shù)來看，一般的PCR 法、PCRCE 法、PCR-DHPLC 法、PCR-DGGE 法、qPCR 法和巢式PCR 技術(shù)等均可用于溺死的診斷。其中，一般的PCR 法成本最低，其次由于PCR-CE 設(shè)備在法醫(yī)裝備中的普及，PCRCE 法使用成本也比較低，是利于基層開展基因檢測技術(shù)用于溺死定性診斷的兩種方法。用于溺死地點推斷研究的檢測技術(shù)中，PCR-DHPLC 法、PCR-DGGE 法和qPCR 法表現(xiàn)得更加適用，推測是由于其分辨率或靈敏度更高的原因，可更好的將不同的目標產(chǎn)物區(qū)別開來，利于多種種屬的鑒別。除此以外，由于細菌的核酸和RNA 一般為單鏈，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、易降解，因此更合適使用靈敏度高的qPCR 法和巢式PCR 技術(shù)。

5 展望

目前，已有科研人員開發(fā)了相關(guān)浮游生物基因座的復(fù)合擴增體系[44-45]，可同時擴增水中多種有利于診斷溺死的微生物的基因，這無疑比單一檢測某種微生物的某類基因準確性更高。還有研究人員將PCR 探針用于無創(chuàng)性的尸體檢驗中[46]，這也大大的擴展了應(yīng)用范圍，對溺死診斷有著重要的實用價值。基因檢測技術(shù)現(xiàn)已進入三代測序時代，進一步使用該方法檢測各種標記物輔助溺死的診斷相較于傳統(tǒng)的基因檢測方法在大規(guī)模檢測上無疑更加有優(yōu)勢。因此，增加基因檢測速度、提高基因檢測精度、擴大基因檢測范圍是目前基因檢測技術(shù)用于溺死診斷的研究方向。