甘薯G病毒基因克隆及組培快繁苗病毒檢測

蔣素華 白冰洋 牛蘇燕 邰作峰 梁芳 袁秀云 崔波

摘要：為了脫除甘薯G病毒，獲得優良的脫毒甘薯種苗，提高甘薯的質量和產量，根據NCBI上已報道的甘薯G病毒外殼蛋白基因序列設計引物，用RT-PCR克隆了商薯19葉片G病毒外殼蛋白基因序列。測序結果顯示，獲得的G病毒外殼蛋白基因為800 bp，與報道的基因序列同源性達99%。經過莖尖脫除病毒和組織快繁技術發現，商薯19芽誘導的最適培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA;苗增殖的最佳培養基為1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 g/L 椰汁水;根誘導的最適培養基為1/2MS+0.5 mg/L NAA。經過PCR檢測，商薯19中確實存在G病毒，經過莖尖脫除病毒后，G病毒的脫毒率達到83%。這為獲得甘薯脫毒苗及甘薯病毒檢測提供了實踐操作的依據。

關鍵詞：甘薯;G病毒;基因克隆;病毒檢測;組培快繁苗

中圖分類號：S531.01;S531.043 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）24-0060-04

收稿日期：2021-04-23

基金項目：河南省高等學校重點科研項目（編號：21B210011、21A210029）;河南省科技攻關計劃（編號：202102110167）;河南省科技特派員經費項目。

作者簡介：蔣素華（1983—），女，河南漯河人，碩士，副教授，主要從事花卉分子生物學研究。E-mail：jiangsuhua2006@163.com。

通信作者：崔 波，博士，教授，主要從事植物分子生物學研究。 E-mail：laocuibo@163.com。

甘薯種植作為我國覆蓋范圍較為廣泛的農作物生產類型，在我國南北地區均有發展，病毒病在我國各個甘薯種植區快速大范圍的蔓延，對甘薯質量和產量造成了巨大的損失[1-4]。在傳統種植模式中，由于缺乏對種薯塊根內病毒的有效處理技術，導致我國甘薯生產效益不同程度地降低，近幾年甘薯脫毒技術雖不斷改進和發展，但是真正能用于實際生產并且大面積使用的脫毒技術還未見報道。因缺乏可大范圍推廣的脫毒技術，故甘薯脫毒技術及脫毒甘薯種植仍處于初步發展階段，還無法在全國推廣。

甘薯G病毒（SPVG）屬于馬鈴薯Y病毒屬病毒，是單鏈的RNA病毒，對主要侵染的甘薯病毒SPFMV和SPCSV有很重要的協同作用[5-6]。馬鈴薯Y病毒屬基本都有一個高度保守的區域，即DAG（Asp-Ala-Gly）三聯體，它在病毒外殼蛋白（CP）的 N-末端[7]。甘薯G病毒序列保守性特點為采用RT-PCR的方法檢測G病毒提供了方便。甘薯是通過營養體繁殖的，病毒極易傳遞給后代[8]。迄今為止，國內外尚未培育出高抗病毒的實用甘薯品種或者能抵抗病毒侵染的高效農藥[9]。多年來，海內外的專家學者都致力于探討高效的甘薯脫毒方法[10-13]。伴隨著組織培養技術的發展，利用莖尖進行甘薯脫毒，為甘薯植株脫毒提供了一條新途徑，成為無毒甘薯生產的首要方法[14-16]。但莖尖組培快繁技術要求高，難度較大，再生植株的分化受甘薯品種、培養基成分等因素的影響，導致成苗率不高，于是探究最高效的甘薯莖尖分生組織培養方法很有必要。本研究采用RT-PCR的方法從商薯19葉片中克隆出G病毒外殼蛋白基因，建立了一套甘薯G病毒檢測體系，并利用組織培養快繁技術，探討不同植物生長激素組合對商薯19莖尖的誘導、分化、增殖以及生根的影響，為推廣商薯19脫毒苗和高效病毒檢測方法提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 甘薯樣品、菌株和載體

商薯19于2020年8月取自鄭州師范學院新溝村試驗田。菌株DH5α（大腸桿菌），克隆載體pMD19-T Vector，均購于TaKaRa公司。

1.2 試劑

dNTP、DNA marker均購自TIANGEN公司;反轉錄酶、RNA酶抑制劑、rTaq酶購自TaKaRa公司;其他為國產純化試劑。

1. 3 引物的設計與合成

從NCBI下載G病毒基因的核苷酸序列，利用Primer 5.0生物軟件以及DNAMAN軟件設計1對引物：GCPF，GCAGGAAAAACAGGAAACAC;GCPR，TGTAGACCATACCTCGGCAT。

1.4 商薯19葉片總RNA提取及目的基因克隆

取0.1 g商薯19葉片，在液氮中迅速研磨成粉末，提取總RNA，鑒定完整性。

以商薯19葉片總RNA為模板，利用M-MLV反轉錄酶合成單鏈cDNA。

以單鏈cDNA為模板進行PCR擴增反應，回收甘薯G病毒目的片段，PCR產物進行電泳檢測，利用DNA回收試劑盒獲取G病毒目的基因。

1.5 目的基因的連接、轉化及陽性克隆測序

將所獲取的目的基因與pMD19-T載體進行連接，轉化DH5α，PCR擴增，電泳檢測確定為陽性的單克隆，送到上海英駿生物技術有限公司測序，并與數據庫核酸序列進行比較。

1.6 脫毒苗快繁體系的建立

1.6.1 無菌芽的獲得 以健壯、無病斑商薯19薯塊為材料，用1%高錳酸鉀處理15 min，再用0.5%多菌靈浸泡1 h，撈出晾干后置于滅菌水（0.1%多菌靈）中在恒溫（28 ℃）和相對濕度80%～85%條件下進行催芽。待薯芽萌發后，在35～40 ℃（8 h/d）下培養30 d。當薯芽長至10 cm左右時，用無菌解剖刀切下頂部約3 cm芽段，剪去多余的葉片，放入燒杯滅菌消毒后，利用3種不同消毒方法（表1）進行處理，進行無菌播種。

1.6.2 莖尖培養 切取莖尖頂端（約1 cm），用已消毒的解剖刀在40倍解剖鏡下切除較大的葉原基，用解剖針切下位于莖尖頂端的生長點。每個培養皿中分別接種3～4個。分別用3種培養基進行培養，編號A1、A2、A3，所用培養基及生長狀況見表2。

1.6.3 苗的增殖 莖尖30 d后可分化出苗，然后進行增殖培養，分別采用3種不同的培養基進行培養，編號B4、B5、B6，每個培養瓶中接種3～5個，所用培養基及增殖狀況見表3。

1.6.4 脫毒苗根的誘導 在無菌條件下，將無菌苗剪切成帶有1葉1節的小段，誘導生根。采用3種不同的培養基進行生根誘導，編號C7、C8、C9，每組所用培養基配比不同，所用培養基及根的誘導情況見表4。

1.7 病毒檢測

當莖尖幼苗長至6～7張葉片時，進行 RT-PCR 病毒檢測， 挑取6株長勢較好的商薯19幼苗，編號為1、2、3、4、5、6，分別提取總RNA，檢驗完整性，以總RNA為模板合成單鏈cDNA，PCR擴增，產物經電泳檢測目的條帶。已經成功脫毒的幼苗可進行快速繁殖生產，將未脫毒的幼苗淘汰或進行莖尖分生組織培養再次脫毒。

2 結果與分析

2.1 G病毒基因的克隆

2.1.1 提取總RNA RNA檢測結果如圖1所示。28S、18S、5S條帶均存在，28S約為18S亮度的2倍，說明商薯19葉片中RNA完整性很好，能夠滿足基因克隆的要求。

2.1.2 目的基因克隆及檢測 利用RT-PCR從商薯19葉片總RNA中擴增出目的片段（圖2）。對其進行回收、連接、轉化、PCR檢測、測序，得到800 bp的DNA序列，與NCBI發表的序列相似度達到99%，說明已經獲得G病毒基因序列。

2.2 甘薯脫毒苗組培快繁

2.2.1 不同表面消毒方法對莖尖成活率的影響 由表1得出，外植體以處理A效果最佳，處理B的效果次之，處理C的效果最差?？梢姡然臏缇Ч却温人徕c較好，將處理A和處理B對比發現，0.1%氯化汞滅菌時間對莖尖成活率也有一定的影響。綜合不同的滅菌方法的結果來看，最佳選擇是處理A。

2.2.2 莖尖誘導 外植體莖尖接種25 d后觀察其誘導情況，在加入6-BA和NAA組合的培養基中，無菌芽尖形成綠色緊實的愈傷組織，容易分化出芽（圖3）;在加入激素KT的培養基中，無菌芽尖形成黃綠色松散的愈傷組織，不容易分化出芽，說明KT的莖尖誘導效果不好;在不加激素的MS培養基中，無菌芽尖形成少量的愈傷組織，且需要的時間長，說明莖尖誘導需要加入一定量的激素，莖尖誘導的最佳培養基為1號。

2.2.3 苗的增殖 莖尖愈傷組織15 d后即可分化出成苗（圖4），30 d后長出6～7張葉片（圖5） 。從3種培養基的增殖情況可知，6-BA可有效誘導苗的增殖，但較低濃度的效果不佳，6-BA與CW的組合效果最佳，6-BA與NAA的組合不利于葉的生長，綜合3種培養基中苗的長勢來看，適宜增殖的最佳培養基為4號培養基，苗生長快，健壯，葉綠。

2.2.4 生根培養 試驗表明，NAA有利于單莖苗的誘導生根，濃度稍高的NAA效果更好。綜合3種不同培養基中多數幼苗的生根情況來看，誘導生根培養基的最佳選擇為7號，生根多而且健壯，有利于后期整棵植株的營養供應（圖6）。

2.3 病毒檢測

檢測結果（圖7）顯示， 6株商薯19幼苗葉片的總RNA完整性很好。單鏈cDNA經PCR擴增及電泳檢測結果見圖8，編號為1、2、3、4、5的植株均無目的基因條帶，說明均已脫毒成功，6號有明顯的G基因條帶，說明脫毒未成功，G病毒脫毒率達到83%。已經脫毒的商薯19幼苗可以進行脫毒苗快速繁殖培養，將未脫毒的幼苗淘汰或繼續脫毒。

3 討論與結論

莖尖分生組織培養技術是當前獲取和培養脫毒苗的主要手段[17-18]。本研究以商薯19的莖尖為外植體，通過建立RT-PCR病毒檢測體系，篩選出成功脫毒的幼苗，并初步建立了甘薯的脫毒苗組培快繁體系。本試驗選取的研究對象是商薯19，建立了G檢測方法和脫毒苗快繁體系。試驗表明，在商薯19莖尖表面消毒過程中發現，以0.1%氯化汞滅菌6～7 min為宜，低于6 min外植體容易發生不同程度的污染，高于7 min外植體容易死亡，且0.1%氯化汞滅菌效果好于10%次氯酸鈉。由于氯化汞屬于重金屬，使用過的氯化汞應做特殊處理[19]。

脫毒苗快繁技術的關鍵在于剝離的莖尖進行誘導分化，在培養基中加入適量的6-BA和NAA有利于芽的誘導分化，但要注意濃度應適中，過高或過低都不利于甘薯莖尖的誘導分化[19]。

在病毒檢測過程中，應選取長勢較好的商薯19幼苗來檢測其脫毒是否成功，因為脫毒成功的幼苗要進行脫毒苗快速繁殖，所以要選取長勢較好的幼苗，以便后代能遺傳得到優良的性狀，達到提高產量和質量的目的。

脫毒苗快速繁殖利用單莖苗來進行，MS培養基和1/2MS培養基是適合商薯19生根的基本培養基，在培養基中加入適量的NAA有利于單莖苗誘導生根，并且生出的根粗壯，有利于后期成苗的營養吸收[19]。

在將莖尖分化出的苗從培養皿移植到培養瓶中時，要注意輕輕夾取，避免用力過猛而損傷莖和葉[20-21]。同時試驗要在乙醇燈旁操作，避免空氣中的細菌污染培養基及莖尖分化組織，此外，操作時動作要快，避免乙醇燈熱量灼傷莖尖分化組織。

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