甜菜夜蛾SeKr-h1基因分子表達特性及其對保幼激素類似物的響應

趙靜 譚永安 房菊 朱友雯 姜義平 肖留斌

摘要：Krüppel homolog 1（Kr-h1）是保幼激素（JH）的早期響應基因，在JH抑制幼蟲或若蟲變態及促進成蟲生殖中發揮關鍵作用。利用 RT-PCR技術克隆甜菜夜蛾SeKr-h1α基因，并進行了生物信息學分析，序列分析結果顯示，SeKr-h1α開放閱讀框長度1 068 bp，編碼355個氨基酸。與美國國家生物技術信息中心（NCBI）上已有的甜菜夜蛾Kr-h1β序列相比，SeKr-h1α N端缺少12個氨基酸。通過熒光定量qPCR研究甜菜夜蛾不同發育時期SeKr-h1α/β的表達水平，結果顯示，SeKr-h1α/β表達趨勢一致，SeKr-h1α為主要表達的轉錄產物。SeKr-h1α/β在幼蟲末期、預蛹和成蟲期高表達，1～4齡幼蟲和蛹期維持低表達。在幼蟲和蛹末期施用JH類似物Methoprene，qPCR檢測SeKr-h1對JH的誘導響應表達，結果顯示Methoprene處理5齡幼蟲2、6、24 h都可誘導SeKr-h1表達，并且在處理6 h時的誘導效果最為明顯，為對照的8.76倍;Methoprene處理化蛹末期的雌蛹，試驗組羽化12 h雌蟲SeKr-h1表達量為對照組的3.34倍。本研究克隆得到SeKr-h1α完整編碼序列，并明確SeKr-h1的表達特性及其對JH類似物存在誘導響應，為進一步深入研究甜菜夜蛾SeKr-h1基因功能以及開發防控新策略奠定了良好基礎。

關鍵詞：甜菜夜蛾;SeKr-h1;基因克隆;表達特性;JH類似物

中圖分類號：S433.4 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）24-0114-07

收稿日期：2021-04-21

基金項目：國家自然科學基金（編號：31901889）;國家重點研發計劃（編號：2017YDF0201900）;國家農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-15-19）。

作者簡介：趙 靜（1989—），女，江蘇宜興人，博士，助理研究員，主要從事經作蟲害防控研究工作。E-mail：jingzhao0126@126.com。

通信作者：肖留斌，碩士，研究員，主要從事經濟作物害蟲防控研究工作。E-mail：xlbwll@sohu.com。

甜菜夜蛾[Spodoptera exigua （Hǜbner）]是一種世界性分布、間歇性發生的雜食性害蟲，危害棉花、蔬菜等多種作物[1-2]。近年來，隨著轉基因棉種植面積擴大，棉田生物群落結構與功能發生了相應的變化。原本為次要害蟲的甜菜夜蛾在棉花上的發生日益嚴重，逐漸成為危害棉花生產的主要鱗翅目害蟲[3-4]。同時，甜菜夜蛾已對氯蟲苯甲酰胺、茚蟲威等多種殺蟲劑產生較高的抗藥性，亟需開拓新的防控靶標[5]。甜菜夜蛾一生經歷卵—幼蟲—蛹—成蟲的變化過程，開展影響甜菜夜蛾變態發育關鍵基因的研究，對于發展甜菜夜蛾新的防控手段具有重要意義。

保幼激素（juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（ecdysteroids，20E）是參與調控昆蟲蛻皮和變態發育最重要的2種激素[6-7]。近年來隨著分子生物學的發展，保幼激素調控昆蟲變態發育的分子機制取得了較大的進展，JH主要受體蛋白met及多個下游響應基因相繼被鑒定[8]。Krüppel homolog 1（Kr-h1）是一種含有8個鋅指結構（C2—H2）的轉錄因子，在家蠶（Bombyx mori）、麥紅吸漿蟲（Sitodiplosis mosellana）等昆蟲中，Kr-h1被證實是保幼激素早期響應基因[9-11]。用JH類似物Methoprene點滴或注射家蠶4、5齡幼蟲，發現JH能誘導家蠶體內BmKr-h1的表達上調[9-10]。JHⅢ對麥紅吸漿蟲滯育幼蟲有劑量依賴性的誘導作用。用0.1～0.3 pg/nL Methoprene注射滯育幼蟲6 h，Kr-h1表達量隨著濃度升高而增加[11]。目前，NCBI上已登錄有20多種昆蟲的Kr-h1基因序列，大多數昆蟲的Kr-h1只有1個轉錄產物，但是在果蠅（Drosophila melanogaster）和家蠶中除外，果蠅存在3種可變剪接的轉錄產物，分別為Kr-h1α、Kr-h1β、Kr-hλ;而家蠶BmKr-h1有BmKr-h1α和BmKr-h1β共2種轉錄產物，BmKr-h1α蛋白比BmKr-h1β蛋白在N端多了十幾個氨基酸[9，12]。

在不同昆蟲中，Kr-h1被證實參與變態發育、生殖生理等過程[13]。赤擬谷盜（Tribolium castaneum）幼蟲末期TcKr-h1短暫高表達對蛹的形成非常重要。干擾幼蟲末期TcKr-h1瞬時高表達，會引起E93的表達上調，從而引起蟲體直接跳過蛹期到達成蟲期[14]。在飛蝗（Locusta migratoria）、大猿葉甲（Colaphellus bowringi）等昆蟲中，施用JH類似物促進Met及Kr-h1的轉錄，進而促進與生殖相關的卵黃原蛋白Vg/卵黃原蛋白受體VgR基因表達，最終影響卵巢發育與成熟[15-16]。除了調控昆蟲生長發育與生殖，在蜜蜂（Apis mellifera）及果蠅中，Kr-h1還能影響覓食行為以及神經元細胞形成[17-18]。

Kr-h1是參與昆蟲變態發育的關鍵基因。目前，在NCBI 上僅登錄甜菜夜蛾SeKr-h1β（S. exigua Krüppel homolog 1β）序列，但對于甜菜夜蛾SeKr-h1的分子特性、表達模式及對JH響應機制還未有報道。基于實驗室前期測得的甜菜夜蛾轉錄組數據，筆者檢測到甜菜夜蛾SeKr-h1還存在另一個轉錄本SeKr-h1α。本研究利用RT-PCR技術，對甜菜夜蛾的SeKr-h1α基因進行了克隆、測序和基本的生物信息學分析，同時通過qPCR技術明確了SeKr-h1α/β在不同發育階段的表達特性以及對JH存在誘導響應表達，為進一步研究甜菜夜蛾SeKr-h1基因的功能以及基于SeKr-h1基因開發害蟲防控手段奠定良好的基礎。

1 材料與方法

試驗于2020 年在江蘇省農業科學院植物保護研究所完成。

1.1 試驗材料

供試甜菜夜蛾蟲源采自江蘇省南京市江寧區的郊區，于江蘇省農業科學院植物保護研究所養蟲室用人工飼料對其繼代培養。甜菜夜蛾飼養條件為溫度（25.5±1） ℃，相對濕度（65±5）%，光—暗周期14 h—10 h，成蟲期補充10%蜂蜜水。

1.2 方法

1.2.1 甜菜夜蛾SeKr-h1α基因的克隆

采用Trizol法提取甜菜夜蛾雌成蟲的RNA，并反轉錄為cDNA。將羽化1 d甜菜夜蛾蟲體放入研缽中，加入少量的液氮，將蟲體充分研磨至粉末狀，收集 0.05～0.1 g組織量至離心管并加入1 mL的Trizol試劑，按照試劑說明書提取總RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA條帶完整性，并用紫外可見分光光度計確定RNA質量和濃度。通過M-MLV反轉錄酶體系對樣品RNA進行反轉錄，所得cDNA于-20 ℃冰箱中保存，備用。

基于測得的甜菜夜蛾轉錄組序列，設計引物通過RT-PCR擴增SeKr-h1α的全長，引物序列見表1。通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的片段產物，回收鑒定正確的產物并連接pClone007載體，室溫（22～30 ℃）反應5 min，將連接產物轉化DH5α感受態細胞，最后通過菌落PCR篩選陽性轉化子，并送上海生物工程有限公司測序。

1.2.2 甜菜夜蛾SeKr-h1α序列結構分析及系統進化樹的構建

為驗證克隆得到的SeKr-h1α序列的可靠性，利用NCBI的Blast工具將其與GenBank數據庫中的其他物種進行同源性序列比對。采用DNAMAN 6.0軟件預測SeKr-h1α蛋白分子量和等電點。采用 NCBI的CCD軟件進行SeKr-h1α功能結構域預測。用Signal 3.0在線軟件對SeKr-h1α進行信號肽分析。利用 NetPhos及 NetGlycate在線軟件對其進行磷酸化位點預測和糖基化分析。使用Clustal W 軟件對鱗翅目Kr-h1氨基酸序列進行比對。采用MEGA 5軟件NJ法構建昆蟲Kr-h1系統發育樹。

1.2.3 甜菜夜蛾不同發育階段SeKr-h1α/β的表達動態

收集甜菜夜蛾1～5齡幼蟲，預蛹，化蛹1、3、7 d的雌、雄蛹，羽化1～3 d的雌、雄蛾，立即放置液氮中冷凍，-80 ℃保存以備提取RNA以及熒光定量qPCR試驗。

根據甜菜夜蛾SeKr-h1α/β基因序列分別設計qPCR引物（SeKr-h1α：Krα-Q887F，Krα-Q1081R;SeKr-h1β：Krβ-30F，Krβ-179R），進行qPCR分析。引物序列見表1，以Actin為內參基因。用以TB Green 為染料的熒光標記法進行qPCR定量檢測。20 μL qPCR體系：TaKaRa TB Green Premix Ex TaqTM 2 μL、引物各 0.4 μL、模板 cDNA 2 μL、ddH2O 7.2 μL。反應條件：95 ℃預變性 30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 10 s，共 40個循環。不同發育時期樣品各3個生物學重復和4個技術重復，每個生物學重復取3頭試蟲。

1.2.4 SeKr-h1對保幼激素類似物誘導響應表達的qPCR檢測

將保幼激素類似物Methoprene（Sigma，美國）通過丙酮稀釋成5 μg/μL的母液，封存于-20 ℃。挑選健康的、大小一致的5齡3 d幼蟲，并用無菌水清洗蟲體表面的飼料，用濾紙吸干水分，通過微量注射儀點滴1 μL于幼蟲的第2與第3胸節之間，并以丙酮作為對照。分別收集對照幼蟲以及用Methoprene處理2、6、24 h的幼蟲各4組，每組3頭，用液氮快速冷凍蟲體，保存于-80 ℃。

選取大小一致、體色發黑、化蛹7 d的甜菜夜蛾雌蛹，通過微量注射儀注射，每頭蛹施用量為1 μL，以丙酮作為對照。將注射后的蛹放入玻璃缸中，為防羽化后飛出用紗布覆蓋缸口并用橡皮筋扎緊。將玻璃缸置于恒溫箱正常飼養，分別收集羽化12 h的雌成蟲以及對照成蟲各4組，每組3頭。

按“1.2.1”節的方法將上述收集的樣品提取RNA，并反轉錄成cDNA，利用qPCR檢測JH類似物施用組和對照組SeKr-h1的表達情況。

1.3 數據分析

基因表達相對量的變化采用2-ΔΔCT法[19]表示，采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，并用Tukey’s HSD 法進行差異顯著性檢測。

2 結果與分析

2.1 SeKr-h1α基因克隆與序列特征

基于甜菜夜蛾的轉錄組序列，根據預測序列設計引物，通過RT-PCR擴增SeKr-h1α基因。在圖1的電泳圖中顯示擴增得到1條1 000 bp左右的條帶。序列分析顯示，其完整編碼序列全長1 068 bp，GC含量達到44.5%，編碼 355個氨基酸，預測的MW分子量約為39.35 ku，等電點PI為8.93。用NetGlycate以及Signal 3.0在線軟件對SeKr-h1α進行糖基化和信號肽分析，發現SeKr-h1α不含糖基化修飾位點和信號肽，暗示SeKr-h1α可能為一種無糖基化修飾的非分泌型蛋白。利用 NetPhos 軟件對SeKr-h1α蛋白進行預測，結果顯示，SeKr-h1α有37個磷酸化位點，分別為19個Ser、17個Thr 和1個Tyr。

2.2 SeKr-h1α氨基酸序列結構比對

與NCBI上已有的甜菜夜蛾Kr-h1氨基酸序列比對，發現本研究克隆的SeKr-h1 N端存在差異，缺少12個氨基酸，為Kr-h1α，NCBI的Kr-h1序列為Kr-h1β（圖2-A）。鱗翅目不同物種 Kr-h1的氨基酸序列進行多序列比對結果（圖2-B）顯示，所有昆蟲都有8個典型的鋅指結構域。與比對的鱗翅目其他昆蟲類似，SeKr-h1蛋白的C端還包含2個蛋白互作基序（LPPRKR 和SVIQFA）。對鱗翅目現有SeKr-h1氨基酸序列比較，除了SeKr-h1β，甜菜夜蛾SeKr-h1α與球菜夜蛾（Agrotis ispilon）最相似（92.11%），其次是棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）（89.80%），梨小食心蟲（Grapholita molesta）（86.04%）。

2.3 昆蟲Kr-h1系統發育樹分析

為了解不同昆蟲Kr-h1蛋白之間的進化關系，以人類的Kr-h1為外群，基于14種昆蟲的Kr-h1氨基酸序列構建系統發育樹。從圖3可以看出，SeKr-h1與同源自鱗翅目的棉鈴蟲以及球菜夜蛾Kr-h1親緣關系最近，形成姐妹群。相比鞘翅目和膜翅目，鱗翅目與雙翅目Kr-h1親緣關系更近。

2.4 甜菜夜蛾不同發育時期SeKr-h1α/β表達趨勢

通過熒光定量qPCR分析SeKr-h1α/β在甜菜夜蛾不同發育時期的表達情況，結果（圖4）顯示，SeKr-h1α/β表達趨勢一致，SeKr-h1α為主要表達的轉錄產物。SeKr-h1α/β在1～4齡幼蟲低表達，進入5齡后表達量上升，至預蛹階段表達量達到峰值后開始下降，在蛹期維持低表達（圖4-A）。SeKr-h1α/β在成蟲期高表達，雌成蟲表達量先上升后下降，在羽化1 d時達到峰值（圖4-A）;雄成蟲表達量穩步上升，在羽化3 d時達到最高（圖4-B）。

2.5 甜菜夜蛾SeKr-h1對JH類似物的誘導響應

為進一步探究SeKr-h1對激素的誘導響應，用保幼激素類似物Methoprene點滴甜菜夜蛾5齡3 d幼蟲和注射化蛹7 d的雌蛹（5 μg/頭），于處理后不同時間取樣檢測SeKr-h1的表達水平。熒光定量qPCR 結果顯示， Methoprene處理2、 6、24 h都可誘導5齡幼蟲SeKr-h1的表達，并且在處理6 h時的誘導表達效果最好，為對照的8.76倍;處理2 h和24 h時，SeKr-h1表達量分別為對照的4.88倍和2倍（圖5-A， P<0.05）。 用Methoprene處理化蛹末期的雌蛹，試驗組羽化12 h雌蟲SeKr-h1表達量為對照組的3.34倍（圖5-B，P<0.05）。 該結果表明甜菜夜蛾SeKr-h1在幼蟲期和成蟲期受到JH的調控。

3 討論

Kr-h1是JH的早期響應基因，近年來對昆蟲Kr-h1的研究逐漸增多，根據NCBI上提供的信息，擁有完整8個鋅指結構（Zn1～Zn8）的Kr-h1基因已超過20個。目前，克隆的大多數昆蟲Kr-h1只有1個轉錄本，但家蠶和果蠅存在2種及以上轉錄本，其中共有的轉錄本為Kr-h1α及Kr-h1β，Kr-h1α蛋白比Kr-h1β蛋白在N端多了十幾個氨基酸，Kr-h1α被認為參與了昆蟲的變態發育過程[9，12]。依據甜菜夜蛾轉錄組數據庫，同時借助 RT-PCR 技術，克隆擴增了SeKr-h1的開放閱讀框序列，與NCBI上已有的甜菜夜蛾Kr-h1序列相比，N端氨基酸存在差異，缺少12個氨基酸，經鑒定為α蛋白。對不同鱗翅目昆蟲Kr-h1蛋白的氨基酸結構進行比較，發現它們存在8個高度保守的鋅指結構域。研究表明，Kr-h1通過保守的鋅指結構結合靶基因的CACCC或GC等位點，進而調控靶基因[20]。鋅指結構域的數量在大多數昆蟲中為8個，但是在寄生類昆蟲中存在缺失，如人頭虱（Pediculus humanus）沒有Zn7，麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）的Kr-h1蛋白只有Zn4和Zn7[21]。寄生類昆蟲Kr-h1 鋅指蛋白個數的缺失推測可能與這2種昆蟲鋅指結構功能退化以及結構冗余性有關。

Kr-h1的表達具有發育時期特異性，在大多數昆蟲的幼蟲向蛹轉變期以及成蟲期高表達。家蠶BmKr-h1α/β在幼蟲、蛹及成蟲3個階段都有表達，表達趨勢一致，但BmKr-h1α表達豐度遠高于BmKr-hβ。BmKr-h1α/β在家蠶5齡幼蟲初期表達量極低，進入5齡末期表達量開始急劇上升然后下降，蛹期維持低表達，成蟲期高表達[9]。梨小食心蟲Kr-h1在幼蟲期低表達，在預蛹期表達量先上升后下降，成蟲期表達量穩步上升[22]。與家蠶類似，甜菜夜蛾SeKr-h1α為主要表達的蛋白形式，在預蛹期和成蟲期高表達，可能參與幼蟲向蛹及蛹向成蟲轉變的激素信號轉導。在果蠅中，Kr-h1β主要在其胚胎發育時期的中樞神經表達，而Kr-h1α的表達則貫穿了幼蟲的整個時期，在預蛹期的初期表達量較高，同時大部分缺少Kr-h1α的蟲體會在變態時期死亡[12，23];除了參與變態發育，在其他昆蟲中，Kr-h1表達模式還與幼蟲滯育、覓食行為有關。麥吸蟲Kr-h1 mRNA豐度隨著幼蟲進入3齡早期、滯育前期和維持期而增加，并在滯育后靜止期達到峰值[24]。Kr-h1在蜜蜂大腦中的表達受cGMP調控，其啟動子包含一個保守的潛在cGMP反應元件，與覓食行為密切相關[17]。

JH在全變態或半變態昆蟲未成熟期過渡到成蟲階段的過程中發揮了重要的作用[21，25]。Kr-h1被證實參與調控昆蟲JH信號的傳導而發揮變態發育、生殖生理等功能。用JH類似物處理果蠅及家蠶等昆蟲，會促進Kr-h1的轉錄表達，導致幼蟲延遲化蛹并降低20E滴度[26-27]。在赤擬谷盜、果蠅及德國小蠊（Blattella germanica）幼蟲期干擾Kr-h1的表達，會引起蟲體的早熟[14，26-28]。對褐飛虱3齡若蟲注射kr-h1 dsRNA，會導致翅膀發育不良和雌雄成蟲外生殖器畸形[29]。在飛蝗、大猿葉甲等昆蟲中，JH通過其受體Met促進Kr-h1的轉錄，進而促進卵黃原蛋白Vg及其受體VgR的表達，最終影響卵巢發育[15-16]。對球菜夜蛾注射JH抑制劑以及JH類似物，證實Kr-h1受到JH的調控，并影響球菜夜蛾的性行為[30]。本研究對甜菜夜蛾幼蟲和蛹體外施用JH類似物，其試驗結果顯示，SeKr-h1在幼蟲和蛹末期都受到JH的誘導，但其響應機制以及發揮的生理功能仍需進一步的研究。

本研究通過RT-PCR技術克隆了SeKr-h1α的編碼序列，明確了SeKr-h1α/β在幼蟲向蛹轉變期以及成蟲期高表達，該表達特性可能與其調控變態發育、成蟲生殖等功能有關。SeKr-h1的表達在幼蟲和蛹末期都能響應JH類似物的誘導。該研究結果可為以JH信號傳導通路基因為靶標研發新型害蟲控制劑奠定良好的研究基礎。

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