雙調控腫瘤特異性溶瘤腺病毒對卵巢癌靶向治療的研究

趙婷，石琴

卵巢惡性腫瘤是全世界女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，其發病率僅次于子宮頸癌和子宮內膜癌，但是死亡率居三大婦科惡性腫瘤之首。卵巢癌治療主要采取腫瘤細胞減滅術聯合以鉑類為基礎的化療。其中，化療耐藥是卵巢癌高死亡率的重要原因之一。切除修復交叉互補基因1（Excision repair cross complementing group1，ERCC1）是鉑類耐藥最為關鍵的因子，也是目前研究較多的DNA修復基因之一。2018年1—12月，本研究構建了一種雙重調控的新型腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒并以此為載體轉染ERCC1小干擾RNA，來靶向殺滅卵巢癌細胞，進一步研究其滅瘤分子機制，并初步探討其卵巢癌化療增敏效果，以期研究出卵巢癌治療及化療輔助新方案。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和設備

實驗用質粒載體由上海吉凱基因公司實驗構建并保存。正常的卵巢癌細胞系SKOV3 購自美國ATCC 公司，人胚胎腎細胞293t細胞株購自加拿大Microbix Biosystem 公司，DEME培養基、胎牛血清購自GIBCO BRL 公司，噻唑藍（MTT）購自美國Genview 公司，RIPA 裂解液購自碧云天生物公司，磷酸酶抑制劑購自美國Sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購自上海試一化學試劑廠，DHanks 由上海吉凱基因技術有限公司配制，酶標儀購自Tecan infinite公司細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，ERCC1、β-actin、JAK2、STAT、PI3K、Akt 抗體皆購買于美國Abcam 公司，二抗為山羊抗兔IgG（H+L）、山羊抗小鼠IgG（H+L），均購自Thermo Pierce公司，ERCC1干擾序列（siRNA-ERCC1）、陰性對照序列均由上海吉凱基因有限公司設計合成。

1.2 方法

1.2.1 雙調控腺病毒構建及鑒定 使用吉凱基因有限公司提供的pXC-1 載體進行改造，其E1a 基因上游插入了人端粒酶逆轉錄酶啟動子（hTERT），E1b 基因上游插入了缺氧調控元件序列（HRE），于E1a 表達盒上游預留了酶切位點（具體結構模式圖如圖1）。根據Genbank 的ERCC1 基因序列涉及特異siRNA。ERCC1-siRNA 序列為5’-ccAAGCCCTTATTCCGATCTA-3’。同時設計陰性對照序列5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。編 碼siRNA 的DNA（由吉凱基因有限公司合成）結構為：AgeI+U6啟動子+Sense DNA+Loop（TTCAAGAGA）+Antisense DNA+TTTTT+NotI，將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈DNA 進行連接反應，連接后的產物進行轉化、PCR 鑒定及測序、質粒提取后與腺病毒包裝質粒（PBHGE3）一起轉染293 細胞，重組出攜帶ERCC1-siRNA 的雙調控腺病毒（AD-ERCC1-siRNA）及未攜帶ERCC1-siRNA的對照腺病毒（AD-NC-siRNA）。

1.2.2 鑒定 各腺病毒經PCR 擴增鑒定E1a 序列后，于293細胞中反復擴增，氯化氬密度梯度離心純化，TCID50法檢測病毒滴度：挑取病毒克隆噬斑，提取腺病毒DNA，鑒定腺病毒E1a和hTERT序列。

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖能力 將對數期生長細胞離心后，重懸細胞，于96 孔板接種（密度5×10個∕孔），繼續培養，用無血清培養液稀釋病毒ADERCC1-siRNA、AD-NC-siRNA，按照MOL＝5.00、10.00、20.00、40.00、60.00加入100 μL稀釋好的病毒液分別感染細胞，對應于每個病毒感染復數（MOI）值設3 個復孔，于24 h 后向各孔加入MTT 液（5 mg∕mL）20 μL，孵育4 h，終止培養，小心的將孔內上清液吸棄，將100 μL 二甲基亞砜加入各孔，振蕩15 min，待結晶物完全溶解后，利用酶標儀檢測各孔在492 nm波長處的吸光度A值。

根據DDP 作用于SKOV3 預實驗結果，得出DDP IC10（2.26 mg∕L），并設置五個組別DDP IC10（2.26 mg∕L）、AD-ERCC1-siRNA（MOI 30）、AD-NCsiRNA（MOI＝30）、DDP IC10+AD-NC-siRNA（MOI 30）、DDP IC10+AD-ERCC1-siRNA（MOI＝30），MTT法比較各組的吸光度（A）值及細胞增殖抑制率。

1.2.4

AnnexinV-FITC 雙染結合流式細胞術檢測SKOV 3 細胞的凋亡

收集不同作用組的細胞及細胞培養液，按照AnnexinV-FITC試劑盒說明，1 000 r∕min 離心5 min（TGL-16B 臺式離心機上海安亭科學儀器廠），棄上清，用PBS輕輕重懸細胞并計數。取1×10個重懸的細胞，1 000 r∕min 離心5 min，棄上清，加入195 μL AnnexinV-FITC 結合液重懸細胞。加入5 μL AnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。1 000 r∕min 離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞。加入10 μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測。

1.2.5 蛋白質印跡法（Western Blot） 檢測細胞中JAK2、STAT、PI3K、Akt蛋白表達各組細胞轉染后培養24 h，用預冷的RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑分別提取總蛋白并檢測純度。取總蛋白30 μL，進行10%聚丙烯胺凝膠電泳，電至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，用3%牛血清白蛋白室溫下封閉60min，TBST沖洗3次，加入一抗JAK2、STAT、PI3K、Akt，4 ℃過夜孵育，TBST 沖洗3 次，將二抗加入，37 ℃孵育60 min，用TBST 沖洗3 次，暗室下用ECL反應15 min，用Image J 軟件分析，計算細胞中JAK2、STAT、PI3K、Akt蛋白表達量。

2 結果

2.1 RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1 雙調控腺病毒成功構建并可以高效轉染卵巢癌細胞

我們將攜帶ERCC1-siRNA基因的工具載體質粒（載體順序為pU6-MCS-phTERT-E1A-pHREE1B55K-pIX-E2B，克隆位點：Age I、Not I），與腺病毒包裝質粒-PBHGE3一起轉染293 細胞，成功構建雙調控溶瘤腺病ADERCC1-siRNA，見圖1。我們將構建成功的AD-ERCC1-siRNA 病毒增加熒光載體，置于熒光顯微鏡下進行觀察，病毒轉染效率較高，見圖2。

2.2 RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1 雙調控腺病毒對卵巢癌細胞有增殖抑制作用

MTT 方法檢測雙調控腺病毒對卵巢癌細胞SKOV3 細胞的增殖抑制作用，結果提示，當病毒接觸卵巢癌細胞24 h 后發揮出對卵巢癌細胞較明顯的增殖抑制作用，且ADERCC1-siRNA組與AD-NC-siRNA組無明顯差異，在感染強度（MOI）＝30時，卵巢癌SKOV3細胞增殖率下降到50%以下，見圖3和表1。

表1 雙調控腺病毒對SKOV3細胞的半數抑制率病毒濃度

2.3 RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1 雙調控腺病毒對卵巢癌細胞促凋亡作用

將AD-ERCC1-siRNA病毒對卵巢癌細胞作用效果進行了圖像觀察及細胞凋亡實驗，與空白細胞對照組相比，細胞培養24 h后，可見大量SKOV3 細胞形態不規則，細胞體老化分解或者萎縮聚集，胞核深染（顯微鏡放大倍數40倍）。流式細胞實驗顯示AD-ERCC1-siRNA 組細胞凋亡率（5.5±0.75）%較對照組（0.5±0.24）%明顯升高（P＜0.01）。見圖4。

2.4 RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1 雙調控腺病毒高效屏蔽ERCC1 耐藥基因，并可能通過JAK/STAT通路介導殺傷上皮性卵巢癌細胞

我們采用傳統WB 方法對病毒作用后的SKOV3 細胞進行細胞收集以及蛋白提取后檢測。結果顯示AD-ERCC1-siRNA 組作用后細胞ERCC1 蛋白（0.553±0.036）表達較對照組（1.607±0.102）明顯減少（P＜0.01）。JAK2，STAT3 表達量較對照組表達明顯增加（P＜0.01）。同時我們也進行了PI3K∕Akt 通路的相關蛋白檢測，其表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5、表2。

表2 AD-ERCC1-siRNA病毒作用后對ERCC1蛋白及細胞凋亡蛋白影響∕

2.5 攜帶ERCC1-siRNA的雙調控病毒較AD-NCsiRNA 更能增強順鉑的用藥效果，其機制可能與ERCC1耐藥基因成功屏蔽有關

我們采用MTT方法檢測單藥順鉑組、病毒組、聯合組等組別對卵巢癌細胞SKOV3 細胞的殺滅作用，結果提示，五組卵巢癌細胞SKOV3 增殖率均被明顯抑制（P＜0.01），其中攜帶ERCC1-siRNA 的雙調控病毒聯合順鉑組較其余各組抑瘤作用更強，較AD-NC-siRNA+DDP組更能增強順鉑的用藥效果（P＜0.01），而AD-NCsiRNA組與AD-ERCC1-siRNA組對腫瘤細胞作用差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 噻唑藍檢測DDP組、病毒組、聯合組等組別對卵巢癌細胞SKOV3的增殖抑制率

3 討論

卵巢癌以盆腔種植及轉移為主，因病灶位置較深，化療藥物靜脈用藥盆腔局部難以達到有效濃度，治療效果不佳，盆腔灌注的方法亦對正常組織和細胞造成很大損傷。且腫瘤細胞對鉑類藥物產生耐藥性更是阻礙了藥物的抗腫瘤效應，使術后5年生存率徘徊在30%～50%之間。因此，一種腫瘤靶向性強且能逆轉耐藥的卵巢癌治療新方案已經成為婦科腫瘤學重要的研究目標之一。

腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒（RSOAds）載體因其高度腫瘤靶向性及殺傷力引起我們關注，它能感染腫瘤細胞，在其中復制、增殖、裂解、殺傷腫瘤細胞并釋放出更多病毒，感染其他腫瘤細胞進行鏈式殺傷反應，且復制、增殖僅限于腫瘤細胞，對正常宿主組織幾乎無破壞。

目前認為，端粒酶的活化與卵巢癌的發生密切相關，其活性增加在卵巢癌的進展中具有重要意義。在腫瘤細胞的惡性增殖過程中，細胞耗氧量劇增，腫瘤內缺氧微環境誘導缺氧誘導因子（HIF-1）形成，HIF-l在包括卵巢癌在內的多種腫瘤中廣泛存在，它與一系列缺氧反應元件（HRE）結合，從而啟動目的基因的轉錄表達，在腫瘤發生、發展、凋亡、浸潤及轉移等方面起著十分重要的作用。有研究證明HIF-1在卵巢癌、腦癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌等一系列人體實體瘤中均高表達，而在相鄰的正常組織或基質細胞中則無表達。

卵巢癌鉑類耐藥最為關鍵的因子是切除修復交叉互補基因1（ERCC1），也是目前研究較多的DNA 修復基因之一。ERCC1位于人類19號染色體上，參與了DNA 鏈的切割和損傷識別，ERCC1 mRNA 水平可以反映腫瘤組織修復鉑類藥物所致DNA螺旋扭轉的能力，是標志腫瘤病人預后和鉑類化療效果的重要指標。很多研究發現接受以鉑類為基礎的化療病人中ERCC1表達越高，化療效果及病人的預后越差。

綜上所述，我們設想依據惡性實體腫瘤無限增殖和瘤內缺氧環境的存在這兩個主要特征，構建一種人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）啟動子和HIF-1雙重調控的新型腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒并以此為載體轉染ERCC1 siRNA，靶向殺滅卵巢癌細胞同時初步探討其卵巢癌化療輔助效果，以期滅瘤同時增強腫瘤細胞化療敏感性，兩者相輔相成，有效預防腫瘤復發，并減少化療藥物用量，加強化療效果并提高病人生活質量，延長病人生存期。

本研究將hTERT和HIF-1分別插入已刪除病毒復制所必需的E1A、E1B 基因啟動子刪除的腺病毒質粒，成功構建僅在腫瘤細胞內特異性增殖的雙調控溶瘤腺病毒（RSOAd-hTERT-HIF），并以此為耐藥基因ERCC1的siRNA基因載體，進一步包裝成溶瘤腺 病 毒hTERT 啟 動∕HIF -ERCC1siRNA 質 粒（RSOAds-hTERT∕HIF-ERCC1 siRNA），以抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡，達到提高腫瘤基因治療的目的。經鑒定，本研究構建的雙調控腺病毒能夠在卵巢癌細胞中高拷貝增殖，并能成功屏蔽卵巢癌SKOV3細胞中ERCC1耐藥基因，且實現了針對惡性腫瘤端粒酶陽性和缺氧環境的雙調控作用。

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）∕蛋白激酶B（Akt）通路是一個經典的抗凋亡、促存活的信號轉導途徑，由PI3K 家族、Akt 蛋白及其一系列底物組成。PI3K是細胞膜上的表皮生長因子受體（EGFR）細胞內部分的下游分子，EGFR 激活后，PI3K 隨后活化，并進一步磷酸化激活Akt，磷酸化的Akt 直接或間接參與許多生理和病理過程。目前研究表明，PI3K∕Akt轉導途徑是卵巢癌細胞對DDP敏感性的關鍵調控因素。

JAK-STAT 信號通路是一條由細胞因子刺激的信號轉導通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等許多重要的生物學過程。JAK-STAT 信號通路功能廣泛，目前與疾病及藥物創新相關的研究都集中于炎癥性疾病及腫瘤性疾病。

我們選用卵巢癌SKOV3 細胞進行該病毒的細胞學試驗，通過對細胞進行MTT檢測發現此病毒對上皮性卵巢癌細胞株SKOV3具有一定的殺滅作用，且攜帶ERCC1 siRNA后并不影響病毒滅瘤效果；甚至屏蔽ERCC1 基因后還具有明顯順鉑增敏作用。同時進行了細胞凋亡通路的檢測，JAK∕STAT通路的激活可能是該病毒誘導腫瘤細胞死亡的一條重要途徑，PI3K∕Akt 通路尚未發現參與其中。

圖1 成功構建AD-ERCC1-siRNA的相關質粒：1A為攜帶ERCC1-siRNA基因的工具載體質粒；1B為溶瘤腺病毒包裝輔助質粒（PBHGE3）

圖2 構建成功的AD-ERCC1-siRNA病毒增加熒光載體，將病毒轉染后的卵巢癌細胞SKOV3放置于熒光顯微鏡下觀察：2A為正常光線下細胞圖像；2B為熒光顯像（放大倍數為100倍） 圖3 噻唑藍檢測雙調控腺病毒對SKOV3細胞的增殖抑制作用

圖4 攜帶ERCC1-siRNA的雙調控腺病毒（AD-ERCC1-siRNA）作用SKOV3人卵巢癌細胞24 h凋亡效果圖：A為AD-ERCC1-siRNA組；B為細胞對照組

圖5 WB檢測AD-ERCC1-siRNA病毒作用后ERCC1蛋白表達及相關細胞凋亡通路：A為ERCC1蛋白表達，B為細胞凋亡通路蛋白表達

我們首例將雙調控腺病毒應用于婦產科腫瘤，致力構建一種靶向性極高的溶瘤腺病毒應用于卵巢癌的治療，探討其溶瘤機制及化療增敏效果，為卵巢癌的基因治療打下堅實的研究基礎。當然，后續還有一些問題亟待我們不斷進行完善研究，比如探討目的病毒屏蔽ERCC1 耐藥基因后化療增敏分子機制研究及完善相關動物實驗等。（本文圖1～5見插圖1-1）