不同產地佛手的香葉木苷及橙皮苷含量同時測定法

魏瑩，肖莉，楊蘭，廖思維，李艷平，張建武

佛手為臨床常用理氣藥，具有疏肝理氣，和胃止痛，燥濕化痰的作用，來源于蕓香科植物佛手的干燥果實；常用于治療肝胃氣滯、胸脅脹痛、咳嗽痰多、胃脘痞滿等癥。佛手主要含有多糖類、揮發油類、香豆素類、酚酸類和黃酮類等多種生理活性物質。佛手中黃酮類成分除了橙皮苷外，還包括香葉木苷、胡蘿卜苷、3，5，6-三羥基-3’，4’，7-三甲氧基黃酮、3，5，6-三羥基-4’，7-二甲氧基黃酮等。文獻報道，香葉木苷具有良好的生物學活性，有促進細胞生長；誘導大鼠肝微粒體P450酶；抗凝血和抗靜脈血栓形成；抗腫瘤等作用。中國藥典以黃酮中的橙皮苷含量作為質量控制指標。但尚未見對佛手香葉木苷、橙皮苷同時測定方法的相關報道。本研究于2015年9月至2018年6月建立同時測定佛手藥材中香葉木苷、橙皮苷的含量測定方法，可為更好地控制佛手藥材的質量提供方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

昆山市超聲儀器有限公司的超聲波清洗器（KQ-500）；賽多利斯科學儀器有限公司的十萬分之一電子天平（BT25S）；安捷倫科技有限公司的高效液相色譜儀（Agilent-1260）。

1.2 試藥

佛手藥材，經生藥學楊蘭老師鑒定其來源于蕓香科植物佛手的干燥果實；對照品：香葉木苷（購于成都瑞芬思生物科技有限公司，批號D-005-161010），純度≥98.5%，橙皮苷（自制，采用核磁共振碳譜，氫譜和電噴霧電離質譜鑒定，含量采用HPLC峰面積歸一化法測定≥98%）；水為純水（自制，pinchengPCJ-10 純化儀）；乙腈HPLC 級；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

取香葉木苷、橙皮苷對照品適量，精密稱定，分別置10 mL 容量瓶中，香葉木苷先用少量的二甲基亞砜（DMSO）將對照品完全溶解再加甲醇定容，制成香葉木苷對照品母液；橙皮苷用甲醇溶解，定容至刻度線，即得橙皮苷對照品母液。分別各取對照品母液1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液（香葉木苷、橙皮苷30.80、20.32 μg∕mL）。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取佛手粉末（過五號篩）約1 g，于錐形瓶中，精密移取25 mL 甲醇，稱定重量，以500 W，40 kHz頻率超聲提取1.5 h，放冷，再稱定重量，甲醇補重，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液為供試品溶液。

2.3 色譜條件

DiamonsilC（250 mm×4.6 mm，5 μm）的色譜柱；乙腈（A）-0.1%醋酸水（B）（20∶80）的等度洗脫，1.0 mL∕min 的流速；285 nm 的檢測波長；25 ℃的柱溫；10 μL的進樣量。色譜圖見圖1。

2.4 線性關系考察

精密稱取對照品適量，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得混合對照品母液（香葉木苷、橙皮苷分別為61.60，101.60 μg∕mL）。然后稀釋成香葉木苷、橙皮苷含量分別為46.20，50.80；30.80，20.32；15.40，10.16；1.23，0.81 μg∕mL的混合對照品。按上述色譜條件進行測定，以進樣量（ng）為橫坐標（X），色譜峰峰面積為縱坐標（Y），得香葉木苷和橙皮苷的線性方程分別為Y＝0.824X+3.56（r＝0.999 7），Y＝1.537X+5.16（r＝0.999 8），線性范圍分別為12.32～616.00，8.12～1 016.00 ng。

2.5 精密度試驗

取香葉木苷、橙皮苷混合對照品溶液10 μL（香葉木苷、橙皮苷質量濃度分別為32.24，21.16 μg∕mL），在上述相同色譜條件下重復進樣6 次，測定香葉木苷、橙皮苷的峰面積，計算峰面積RSD值分別為0.68%，1.12%，表明精密度良好。

2.6 重復性試驗

稱取川佛手（2 號）樣品共6 份，各約1 g，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，進行含量測定，外標法計算含量，結果香葉木苷的平均含量為0.07%，RSD 為2.20%；橙皮苷的平均含量為0.08%，RSD為2.60%；結果表明重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取川佛手（2號）樣品約1 g，精密稱定，按上述方法制供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12 h 進樣10 μL，測定其峰面積，香葉木苷、橙皮苷的峰面積的RSD 分別為2.41%、2.88%，結果表明供試品溶液在室溫下12 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取（9號）佛手樣品共6 份（9 號藥材中香葉木苷、橙皮苷的含量分別為0.053%、0.029%），每份約0.5 g，分別精密加入含香葉木苷、橙皮苷濃度分別為0.264、0.145 mg∕mL的混合對照品溶液1 mL，參照上述方法制備樣品溶液，再按上述色譜條件進行含量測定，結果見表1。

表1 準確度試驗結果（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取14 批佛手樣品各1 g，精密稱定，分別制備供試品溶液，測定其含量，外標法計算含量，見表2。

圖1 HPLC法測定佛手藥材香葉木苷和橙皮苷的含量的色譜圖：A為混合對照品；B為樣品

表2 不同產地佛手中香葉木苷、橙皮苷含量（n＝4）

3 討論

現今，關于佛手質量控制的報道很多，但未見其香葉木苷、橙皮苷同時測定的方法的文獻報道。橙皮苷和香葉木苷均為黃酮類成分，具有良好的生物學活性。本研究建立兩成分同時測定的方法，并用于不同產地佛手香葉木苷、橙皮苷的含量測定，結果表明，不同產地佛手中兩者含量相差較大，且其中有兩個批次廣佛手（9號，11號）中橙皮苷含量低于2020年版《中國藥典》的規定值0.03%，未達到藥典標準。文獻報道香葉木苷對照品用甲醇溶解，本研究參照文獻采用超聲和加熱都不能使其完全溶解，故先加少量DMSO 待香葉木苷溶解后慢慢加入甲醇，超聲制得香葉木苷對照品母液。在供試品溶液制備中，考察了加熱回流和超聲提取法分別在1.0、1.5、2.0 h提取時間的提取率，結果表明，水浴加熱和超聲提取1.5和2.0 h，提取回收率均在95%（提取1.0 h回收率在80%左右）。超聲提取操作簡便，最終采用超聲提取的方法提取1.5 h。流動相組成考察了甲醇-水，甲醇-0.1%醋酸水，乙腈-水，乙腈-0.1%醋酸水，發現采用乙腈-0.1%醋酸水（20∶80）等度洗脫，兩成分達到基線分離，且在20 min內完成分析。波長的選擇方面，采用UV-1750 紫外可見分光光度計，于200～700 nm 波長范圍內掃描香葉木苷、橙皮苷的對照品溶液，結果香葉木苷275 nm處有最大吸收；橙皮苷在283 nm處有最大吸收，由于兩者洗脫時間接近，故不采用波長變化法進行測定。兩者在285 nm處吸收均強，綜合考慮選擇285 nm為檢測波長。

綜上所述，本研究建立HPLC 法同時測定佛手藥材中香葉木苷、橙皮苷的含量，方法操作簡便、準確可靠和重復性好，可快速準確測定佛手藥材中這兩種成分的含量。