共刺激因子B7 同源體4 蛋白在膽囊腺瘤和膽囊腺癌中的表達

郭偉，陳小爽，王曉磊，展鵬遠

膽囊腺瘤癌變率約1.5%，是公認的膽囊腺癌癌前病變。B7-H4 蛋白于多種惡性腫瘤中表達，許多研究揭示B7-H4 在多種人類實體腫瘤中過表達，表達水平與病人預后不良和臨床轉歸差密切相關，推測其參與了腫瘤的免疫逃避。本研究運用免疫組織化學法（免疫組化），分別檢測膽囊腺瘤和膽囊腺癌中B7-H4 蛋白的表達，對其在膽囊腺瘤惡變過程中有無意義進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河南大學第一附屬醫院2005年6 月至2015 年6 月符合條件膽囊腺癌病例共58例；其中女性36 例、男性22 例；年齡范圍為32～81歲，中位年齡為61歲；WHO 2010年版膽囊癌病理分型：腺癌（乳頭狀型）33例，腺癌（硬化型）13例，腺癌（管狀型）7 例，腺癌（黏液型）5 例；高分化（Ⅰ級）12例，中分化（Ⅱ級）29 例，低分化（Ⅲ級）17 例；AJCC（美國癌癥聯合委員會）和UICC（國際抗癌聯盟）聯合制定的膽囊癌TNM 分期（2015 年）：其中Ⅰ期10例，Ⅱ期5 例，Ⅲ（A+B）期16 例，Ⅳ（A+B）期27 例。對照組選取同期膽囊腺瘤40 例。58 例膽囊癌病人的1 年生存率41.86%，2 年生存率25.58%，3 年生存率5.7%，中位生存時間6.5 個月。本研究中病例均得到病人或其近親屬知情同意，研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 納入標準

①膽囊腺瘤病理明確；②膽囊腺癌病理明確；③臨床資料及隨訪資料完整；④膽囊腺癌術前無抗癌措施。

1.3 主要試劑和實驗方法

主要試劑：mouseB7-H4 MAb（克隆號297219），Rat IgG2B，美國R&D 公司（蘇州瑞諾德生物科技有限公司分包）；通用型超敏S-P免疫組化染色試劑盒。

實驗方法：采集標本玻片，同等條件免疫組化染色。玻片制作流程：10%甲醛溶液固定；石蠟固定后包埋；4 μm切片；乙醇脫水；二甲苯透明。

1.4 結果判定標準

陽性細胞為胞膜和（或）胞質中出現定位良好的黃棕色顆粒，且染色高于背景者。以磷酸鹽緩沖鹽水代替一抗作陰性對照。依據陽性細胞占比和染色強度判讀結果：a 按染色細胞占比計算分數（1分＝陽性細胞數＜1∕3；陽性細胞數1∕3＜2分＜陽性細胞數2∕3；3分＝陽性細胞數≥2∕3）。b 按染色深淺記算分數（0 分＝無染色：淺黃染色記1分；棕黃染色記2分；棕褐染色記3分）。積分數＝a×b。陰性：積分數＝0。陽性：積分數＝0＜（+）≤積分數＝2；積分數＝2＜（++）≤積分數＝4；積分數＝4（+++）≤積分數＝9。

1.5 統計學方法

應用SPSS 17.0進行本研究數據分析。兩指標間關聯分析：采用四格表χ檢驗。多組資料間的兩兩比較：采用行×列χ檢驗。生存率統計分析：采用Kaplan-Mier，Log rank 檢驗。結果判讀以α＝0.05（雙側）檢驗水準，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 B7-H4分別在癌旁正常組織、膽囊腺瘤和膽囊腺癌中的表達

免疫組化顯示：B7-H4 蛋白主要染色于組織細胞的胞膜、胞漿和（或）胞核中。B7-H4蛋白在慢性膽囊炎、癌旁正常組織、腺瘤、腺癌組織中表達率分別為0.00%、0.00%、15.00%、67.24%。慢性膽囊炎（圖1A）和癌旁正常組織（圖1B）無表達；在腺瘤階段以胞膜為主，同時也存在胞質表達（圖1C）；在腺癌階段同時存在核表達、胞質及胞膜表達（圖1D）。

2.2 B7-H4 蛋白在膽囊腺瘤和膽囊腺癌中的表達

B7-H4 蛋白在膽囊腺瘤的陽性表達率15.00%（6∕40），在膽囊腺癌陽性率為67.24%（39∕58），差異有統計學意義（χ＝26.017，P＜0.05）。

圖1 膽囊切除標本的共刺激因子B7同源體4蛋白的檢測結果：A為慢性膽囊炎（SP×40）；B為癌旁正常組織（SP×40）；C為膽囊腺瘤（SP×200）；D為膽囊腺癌（SP×200）

2.3 B7-H4蛋白在膽囊腺癌分級中的表達

B7-H4蛋白在膽囊腺癌低-中分化組的陽性表達率69.44%（25∕36），高分化組的陽性表達率33.33%（4∕12），差異有統計學意義（χ＝4.907，P＝0.027）。

2.4 B7-H4蛋白在膽囊腺癌分期中的表達

B7-H4蛋白在膽囊腺癌TNM（Ⅰ+Ⅱ）中陽性表達率86.67%（13∕15），在膽囊腺癌TNM（Ⅲ+Ⅳ）中陽性表達率60.47%（26∕43），差異無統計學意義（χ＝2.379，P＝0.123）。

2.5 B7-H4蛋白在膽囊腺癌中陽性表達與相關影響因素的分析

B7-H4蛋白陽性表達在年齡和性別差異無統計學意義（P＞0.05）。B7-H4 蛋白陽性表達在伴膽囊結石、腫瘤長徑和有無淋巴結轉移中差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.6 生存分析

Kaplan-Meier生存分析，膽囊腺癌病例中B7-H4 蛋白陽性表達組中位生存期為26 月，95%CI：20.661～31.339，B7-H4蛋白陰性表達組中位生存期為22月，95%CI：6.359～37.641。Log-Rank（Mantel-Cox）顯示：B7-H4蛋白表達陽性組與表達陰性組3年生存期差異無統計學意義（χ＝0.187，P＝0.665）。

表1 膽囊腺癌58例B7同源物4（B7-H4）蛋白表達結果與影響因素的分析∕例

3 討論

膽囊腺瘤是公認的膽囊腺癌的癌前病變。目前認為女性、年齡≥50歲和直徑≥1 cm是其癌變的高危因素，膽囊壁增厚和合并膽囊結石是其癌變的獨立危險因素。但癌變機制尚不清楚。

B7 家族是唯一從抗原遞呈細胞單向傳遞信號到T 細胞的刺激因子，對激活或者抑制T 細胞免疫應答十分重要。其中B7-H4 的基因組DNA 定位于第1 號染色體上，由6 個外顯子和5 個內含子組成。B7-H4 mRNA 廣泛分布于正常組織中，但通過免疫組化法檢測正常人的肝、腎、胰腺、卵巢、腸道等組織中均未見陽性結果，表明正常的外周組織可能在翻譯水平上對B7-H4的表達進行嚴密的調控，而在包括膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、食管癌、宮頸癌、肺腺癌、喉癌、結直腸癌等多種人類實體腫瘤中過表達，且表達水平與病人預后不良和惡性轉歸密切相關，提示B7-H4可能在惡性腫瘤中的發生中發揮作用。作為免疫調節蛋白B7 家族一員，B7-H4 與特異性受體BTLA 分子結合，能顯著抑制T 細胞增殖分裂，阻遏細胞周期連續進行，促進T細胞凋亡，從而在腫瘤免疫中起抑制作用。Choi IH 等研究顯示B7-H4 在大多數正常組織細胞中不表達或低表達，相反在85%卵巢癌和31%肺癌組織中陽性表達，其研究表明：B7-H4 在正常外周組織的翻譯水平上表達受到嚴格調控，B7-H4 可能在逃避腫瘤免疫方面發揮作用。Liu WH 等研究顯示B7-H4 的異常表達可能使本來正常的巨噬細胞擁有了抑制功能，使其可能在膀胱尿路上皮細胞癌細胞逃避免疫系統的攻擊中發揮一定作用。Meng Z等和廖林虹、于曉紅研究亦顯示B7-H4在多種惡性腫瘤中有很高的表達比例，而在正常組織中的低表達或缺失蛋白的表達。何濤等研究顯示過表達B7-H4可導致腫瘤細胞侵襲及轉移能力增加，并發現該過程可能與細胞的EMT轉化PI3K∕AKT通路激活有關，同時也發現，B7-H4與CXCL-12趨化因子及其受體的轉錄及蛋白表達有關，B7-H4表達被下調后，細胞侵襲能力也隨之下調。Zhang C 等發現B7-H4 能夠抑制B7-CD28 的共刺激作用和抑制T細胞分泌IL-10和INF-1等因子。Abadi等發現，剔除B7-H4基因小鼠可顯著抑制乳腺癌細胞的肺轉移。以上證據表明，B7-H4可抑制T細胞介導的抗腫瘤免疫應答，因此，B7-H4 可能作為治療某些腫瘤尤其是高表達B7-H4 的惡性腫瘤的潛在靶點。

本研究亦顯示：B7-H4 蛋白在膽囊腺瘤及膽囊腺癌中均有陽性表達，并且在膽囊腺癌中表達明顯高于膽囊腺瘤；B7-H4 的蛋白陽性表達與膽囊腺癌的分化程度有關，其表達在低、中分化組與高分化組的陽性表達差異有統計學意義，但本研究并未觀察到低、中分化組之間的差異，可能與本研究人數較少有關，今后增加研究人數，分析其相關性。B7-H4的蛋白陽性表達與膽囊結石、腫瘤長徑及有無淋巴結轉移密切相關，但與膽囊病理分期、年齡、性別無相關；膽囊腺癌中有無表達在3 年生存率方面差異無統計學意義。

綜上分析，提示B7-H4 蛋白可能在膽囊腺瘤惡變為膽囊腺癌的起始發生中發揮作用，并使惡性程度升高，其機制有待我們進一步研究。