微小核糖核酸-155、骨橋蛋白、嗜酸性粒細胞趨化因子水平與支氣管哮喘病兒氣管重塑的關系

王莎莎，趙敏，趙育紅，冉桃，宋珊

支氣管哮喘系屬慢性氣管炎性疾病，以氣管高反應性、氣管炎性改變和可逆性氣管阻塞為主要特征，其病理變化過程有多種細胞浸潤參與，包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞及T 淋巴細胞等，對氣管阻塞及氣管高反應程度有重要影響，并決定了病人的病情預后。目前有多項研究表明微小核糖核酸-155（MicroRNA-155，miRNA-155）與肺部疾病相關，嗜酸性粒細胞趨化因子（Eotaxin）為一種可選擇性趨化因子，通過對嗜酸性粒細胞的趨化、募集作用，影響氣管炎癥反應。此外，骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）為非膠原性且帶負電的磷酸化糖蛋白，在人體細胞、組織中廣泛存在，影響炎性因子分泌水平，可作為平滑肌細胞增殖或纖維化的參考指標。以上三者均與哮喘發病過程密切相關，本研究通過檢測miRNA-155、OPN、Eotaxin水平在支氣管哮喘病兒中的表達，目的在于進一步準確評估哮喘病兒氣管重塑情況并對病情預后情況作出判斷，力求為臨床治療方法的改進及治療效果的提高作出重要參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究前瞻性選擇成都市溫江區人民醫院于2016年5月至2018年12月期間收治的160 例急性發作支氣管哮喘病兒，根據高分辨率螺旋CT 診斷結果是否發生氣管重塑分為重塑組（54例）、非重塑組（106 例）；納入該院同期住院的其他呼吸系統疾病病兒60 例為對照組。其中重塑組男30 例，女24 例；年齡（7.19±1.64）歲，范圍為3～12歲；非重塑組：男59 例，女47 例；年齡（7.01±1.56）歲，范圍為3～11歲；對照組：男35例，女25例；年齡（6.97±1.52）歲，范圍為3～11 歲。各組性別（χ＝0.130，P＝0.937）、年齡（F＝0.325，P＝0.723）比較均差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 選取標準

納入標準：（1）所有病兒符合支氣管哮喘診斷標準，確診為支氣管哮喘；（2）3歲≤病兒年齡＜12 歲；（3）近3 d 內有輕度或中度發作史，且未使用抗膽堿能類、β2受體激動劑、糖皮質激素、茶堿類、白三烯拮抗劑和抗組胺類藥物；（4）已獲得病兒近親屬知情同意，病兒理解能力正常且能積極配合相關試驗操作。

排除標準：（1）排除嚴重心臟、肝、腎功能障礙以及實質性病變的病兒；（2）排除急性發作期；（3）排除其他阻塞性呼吸系統疾病。（4）無法配合至試驗結束者。

1.3 研究方法

1.3.1 氣管重塑指標檢測 所有入選受試者均行高分辨率螺旋CT 輔助檢查，以評價氣管重塑情況，所有檢查均于同一CT平面，病兒仰臥并深吸氣屏住呼吸行多排螺旋CT薄層掃描，同時對氣管行估算法三維重建，以120 kV掃描電壓范圍始于肺尖終于肺底，層距10 mm，層厚1 mm，矩陣為512×512，窗位為-450 HU，窗寬為1 500 HU。選擇氣管隆突上下各1 cm、右側肺靜脈下緣2.5 cm和3 cm以及右側膈肌上緣五處其中一處氣管顯示清晰的部位。由兩位具有專業影像資質的醫師單盲狀態下分別測量L（內徑）、D（外徑），T（氣管壁厚度）＝（D-L）∕2、AI（氣管腔面積）、AO（氣管總橫斷面積）、WA%（氣管壁面積占AO 面積百分比）＝（AO-AD）∕AO 數值，測量后取均值，選擇eFilmcare圖像分析軟件，選取L、T、AI、WA 四個指標進行比較。正常人支氣管壁平均為7 μm，哮喘病人支氣管壁平均為17 μm。

1.3.2 肺功能測定 所有受試者入組后由本院具有肺功能測定操作資質的技師通過肺功能儀（SENSORMED-ICS2100）測定肺功能指標包括：（1）用力呼氣量（FVC），FVC%超過80%即為正常，低于80%提示存在肺功能障礙；（2）一秒用力呼氣容積（FEV1），FEV1%低于80%提示存在肺功能受損；（3）一秒率（FEV1∕FVC），FEV1∕FVC%低于70%提示存在氣流阻塞；（4）呼氣峰流量（PEF），所得值越高表明呼吸肌力量以及氣管功能越好。

1.3.3 血清標本采集與處理 所有受試者均于入組后常規監測血壓，監測血常規、嗜酸性粒細胞、C反應蛋白指標：將抽血標本于半小時內通過1 500 r∕min速度離心2次，每次10 min，分離出上層血清后保存于-80 ℃超低溫冰箱內備用。

1.3.4 miRNA-155 檢測 所有受試者入組后均采用Realtime PCR 儀檢測miRNA-155，檢測試劑盒由美國Qiagen 提供，根據說明書分別提取各組用RNA。分別利用紫外分光計測定230、260、280 nm波長的吸光度，進而確定總RNA 的濃度和純度；利用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA中18 s和28 s的比值，評估RNA的完整性和純度。反轉錄為各取總RNA 1 μg，5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’，miR-155 為RT-PCR 引物序列。85 ℃5 min、42 ℃42 min、16 ℃30 min為RT反應程序。PCR實時定量反應體系為：1 μL反轉錄產物，21 μL 2.5 mmol脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP），2.5 μL 10×PCR 緩沖液，1.5 μL氯化鎂溶液，1 U Taq聚合酶，0.25×10 μmol終濃度SYBR Green I 的加水總體積達25 μL 的1 μL PCR 特異引物miR-574-5p：5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’，5’-GGGGGTGAGTGTGT-GTGTGT-3’。

1.3.5 OPN 檢測 所有受試者入組后均于晨起后空腹抽取靜脈血5 mL，常溫下放置20 min，以2 000 r∕min速度離心15 min，分離上層血清并采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測血清OPN 濃度，嚴格按照ELISA試劑盒（上海圻明生物科技有限公司）說明書進行操作。

1.3.6 誘導痰中Eotaxin 細胞計數檢測 所有受試者入組后均通過超聲霧化吸入高滲鹽水（4%）半小時，受試者誘導痰如未一次性成功可休息后病兒配合的情況下隔天再次進行，直至誘導成功，采集痰標本與0.1%二硫蘇糖醇混合并輕微震蕩于恒溫（37 ℃）水浴箱中15 min，待痰液徹底液化后濾除雜質和黏液。采用ELISA檢測嗜酸細胞活化趨化因子細胞濃度，按照試劑盒（美國R&D Systems）說明書進行操作，于酶標儀上根據450 nm主波長和540 nm校對波長對雙波長進行讀數。

2 結果

2.1 氣管重塑指標比較

重塑組、T、WA 均大于非重塑組，對照組最低，重塑組AI 低于非重塑組，對照組最高，均差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 支氣管哮喘病兒（非重塑組、重塑組）與其他呼吸系統疾病病兒（對照組）氣管重塑指標比較∕

2.2 肺功能比較

重塑組FEV1、PEF、FEV1∕FVC均低于非重塑組，對照組最高，均差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 支氣管哮喘病兒（非重塑組、重塑組）與其他呼吸系統疾病病兒（對照組）肺功能臨床指標比較∕

2.3 miRNA-155、OPN、Eotaxin比較

重塑組OPN、Eotaxin 高于非重塑組，對照組最低；重塑組miRNA-155 低于非重塑組，對照組最高，均差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 支氣管哮喘病兒（非重塑組、重塑組）與其他呼吸系統疾病病兒（對照組）微小核糖核酸-155（miRNA-155）、骨橋蛋白（OPN）、嗜酸性粒細胞趨化因子（Eotaxin）比較∕

2.4 相關性研究

Pearson 相關性分析表明，miRNA-155 與WA 呈負相關性，與FEV1∕FVC、FEV1 呈正相關（P＜0.05）；OPN、Eotaxin與WA呈正相關，與FEV1∕FVC、FEV1 呈負相關（P＜0.05）；與其他指標無顯著相關性（P＞0.05），具體見表4。

3 討論

盡早發現病兒氣管重塑，盡早為病兒進行干預性臨床治療現已成為研究哮喘的熱點。以用力呼氣量、一秒用力呼氣容積、一秒率以及呼氣峰流量作為肺通氣功能的重要指標最為常用，可有效反應氣流的阻塞程度。高分辨率螺旋CT 作為無創性輔助檢查，可對100～200 μm氣管結構進行識別，而直徑在1.5～2.0 mm左右的小氣管亦可清晰顯示，對哮喘病兒遠端與近端的氣管重塑情況均有重要的意義。本研究中發現，氣管重塑組病兒氣管內徑、氣管壁厚度和氣管壁面積明顯高于非重塑組，氣管腔面積明顯低于非重塑組，而氣管重塑組病兒的肺通氣功能普遍偏低，氣流受限明顯，對比對照組氣管腔面積最高，余氣管重塑指標均最低，肺通氣功能狀況最好，由此可見，氣管重塑的出現明顯降低了病兒的通氣功能，加重病情。

表4 微小核糖核酸-155（miRNA-155）、骨橋蛋白（OPN）、嗜酸性粒細胞趨化因子（Eotaxin）水平與支氣管哮喘病兒氣管重塑及病情指標Pearson相關分析

miRNA 是在機體發育、生長、分化過程中通過抑制蛋白轉譯或降解mRNA 等方式調控轉錄后基因表達的非編碼微小核糖核酸，在健康人群或患病人群中，其血清均有大量特異表達的miRNAs，且在肺纖維化、肺癌和哮喘等病人體內異常表達明顯。艾紅輝等研究發現miR-155在變應性鼻炎中高表達，且與EOS（%）呈正相關。張熊等發現miRNA-155與支氣管網狀基底膜厚度及成纖維細胞數目具有相關性。本研究發現，隨著病兒氣管壁占氣管總橫斷面積的增高，氣管重塑狀況的加重，其miRNA-155的表達明顯下降，病兒肺通氣功能狀況欠佳；與此同時，miRNA-155 診斷重塑組病兒的靈敏度和特異度為93.11%，進一步表明miRNA-155 表達的越低，病兒氣管重塑狀況和病情越嚴重。相關研究表明，哮喘小鼠存在miRNA-155缺陷時則出現氣管重塑和Th2 細胞反應增加，當哮喘小鼠的miRNA-155被敲除時，其細胞可出現炎性浸潤以及氣管重塑。其作用機制可能是由于樹突狀細胞、淋巴細胞與miRNA-155調節功能相關，當miRNA-155表達較少時可能出現哮喘炎癥反應加重，形成氣管重塑，加重病情。

慢性炎性改變是氣管重塑的關鍵因素，OPN 作為骨基質蛋白參與細胞粘附、凋亡和趨化等等多種病理性炎癥反應，在機體免疫應答和炎癥反應過程中有著重要作用，可使哮喘病情進一步加重，其作用機制主要是OPN 直接或間接與細胞因子和炎性介質相互作用，間接影響中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞和淋巴細胞等炎癥細胞浸潤、趨化的過程。小鼠模型實驗表明，當小鼠處于變應原致敏階段時，OPN 在激發階段以抗炎作用為主，其外源性OPN可引起嗜酸粒細胞增加。此外，OPN亦可密切參與氣管平滑肌的纖維化改變和氣管重塑，主要通過上調血管內皮生長因子、金屬蛋白酶-9 和IL-13 等表達水平促使平滑肌的纖維化增強以及新生血管生成增加。而嗜酸細胞趨化因子是支氣管哮喘病人病情急性發作時的客觀標志物，在氣管上皮內可大量沉積并釋放陽離子蛋白、嗜酸性粒堿性蛋白等效應分子，介導氣管的上皮炎性病變和重塑。其主要通過與EOS表面趨化因子受體選擇性結合，促使EOS炎性聚集。哮喘病兒急性發作時，活化的EOS脫顆粒后釋放大量活性生物蛋白，肥大細胞經誘導后釋放大量組胺，支氣管角質細胞和上皮細胞受介導而損傷或脫落，黏膜通透性改變，感覺神經纖維被暴露，進而出現氣管高反應，病情加重。Takeda等通過對支氣管哮喘相關指標檢測研究發現，隨著病人病情的加重，其氣管重塑狀況越明顯，肺通氣功能越差，OPN、Eotaxin 明顯升高。Naomi等通過對3歲左右支氣管哮喘病兒病情的影響因素發現，miRNA-155、OPN、Eotaxin 對于其病情變化發展有著重要作用，其表達水平的高低可直接影響疾病預后。結合本研究結果：重塑組OPN、Eotaxin高于非重塑組，對照組最低，OPN、Eotaxin 與WA 呈正相關，與FEV1∕FVC、FEV1呈負相關。

綜上所述，聯合檢測miRNA-155、OPN、Eotaxin水平可有效評估支氣管哮喘病兒氣管重塑及病情嚴重程度，為治療方案的調整和療效的提高提供重要依據。