氧化銀鈦納米管治療骨關節假體相關性感染的實驗研究

王成貴，李宣明

人工關節置換術能達到緩解關節疼痛，恢復關節功能的目的。生物材料相關感染是醫療植入物最嚴重的術后并發癥之一，導致病人痛苦，經濟負擔甚至死亡。感染可能是由于術前不完全消毒，外科手術過程中的非標準方案，或手術后細菌從感染的，鄰近的組織和血源傳遞到植入物表面。在細菌到達植入物表面后，它們將聚集在由它們自身分泌的細胞外粘性多糖中以形成生物膜。生物膜使細菌對宿主防御和抗菌劑具有高度抗性，從而導致持續和慢性感染。納米材料可以有效地提高生物材料的生物學性能。Ag 納米顆粒（Nanoparticle，NPS）或鹽目前用于各種醫療材料和設備中以預防感染，例如傷口敷料、燒傷軟膏、導管、血管移植物和骨骼固定裝置。氧化銀鈦納米管（AgO-TiO-NTS）不是將Ag加載到所形成的TiONTS中，而是采用在Ti上沉積TiAg 涂層然后進行陽極氧化的策略來制造負載Ag 的TiONTS。AgO-TiO-NTS 具有嵌入無定形二氧化鈦納米管壁中的結晶AgO NP的獨特結構，并且由于二氧化鈦產生的屏障效應，NT-AgO陣列顯示出較慢的Ag釋放。本研究通過體內外實驗，探討裝載了AgO-TiO-NTS 在治療骨關節假體相關性感染過程中，對表面葡萄球菌及金黃色葡萄球菌的抑菌作用。

1 材料和方法

1.1 一般材料

2018 年5 月至2019 年5 月使用健康新西蘭大白兔32只［由河北大學醫學院實驗動物中心提供。動物許可證號：SYXK（冀）2017-002］，建立人工關節置換術后感染模型，并隨機分為表-Ag釘組（使用AgO-TiO-NTS 復合涂層的螺釘，拆線后1 d，兔術側膝關節注入表皮葡萄球菌懸液，n＝8）、表-普釘組（使用沒有涂層的普通螺釘，拆線后1 d，兔術側膝關節注入表皮葡萄球菌懸液，n＝8）、金-Ag釘組（使用AgO-TiO-NTS 復合涂層的螺釘，拆線后1 d，兔術側膝關節注入金黃色葡萄球菌懸液，n＝8）、金-普釘組（使用沒有涂層的普通螺釘，拆線后1 d，兔術側膝關節注入金黃色葡萄球菌懸液，n＝8）。每組各4 只雄性和4 只雌性，以避免因性激素而產生的性別偏見和不同結果。所有實驗程序均經動物保護和使用委員會批準的方案下進行，根據實驗動物護理和使用指南進行實驗。

1.2 人工膝關節置換大白兔模型

以20%烏拉坦（3 mL∕kg）進行麻醉，在左側髕骨外側0.5 cm處作一長約6～8 cm的縱行切口，將髕骨向外翻開，切除半月板及前交叉韌帶，保留后交叉韌帶。屈膝90°，擴髓，股骨髁和脛骨平臺各截骨2 mm。根據髓腔及骨床的大小選取合適的人工膝關節假體并復位。

1.3 方法

1.3.1 AgO-TiO-NTS 將純Ti 棒切成薄片（F14 mm×2 mm）并用作基材。將樣品拋光至鏡面上，然后分別在丙酮，乙醇和去離子水中依次超聲清洗5 min，并在引入沉積室之前在空氣中干燥。通過脈沖DC 磁控濺射在室溫下用TiAg 靶將TiAg 涂層沉積在Ti 上。在沉積之前，將基板在～800 V 的偏壓，40%的占空比，60 kHz 的脈沖頻率和5.0 Pa 的工作壓力下濺射清洗30 min。然后，在300 的目標功率下進行TiAg 涂層的沉積，脈沖頻率為60 kHz，工作壓力為0.8 Pa，沉積時間為3 h。對沉積的Ti-Ag 涂層進行電化學陽極氧化，以產生AgO-TiO-NTS，如圖1 所示。使用含有0.3%的乙二醇溶液作為電解質。陽極氧化在室溫下以30 V 的恒定DC電勢在具有鉑（Pt）箔對電極的雙電極設置上進行4 h。在陽極氧化之后，立即用去離子水洗滌樣品并超聲清洗以除去殘留的電解質以及表面氧化物層。

圖1 抗菌涂層鈦納米管Ag2O-TiO2-NTS制備示意圖

1.3.2 人工膝關節制備 兔的人工膝關節是仿生關節，基于兔膝關節的解剖形態和生物動力學特點，設計并且用鈦合金（Ti6Al4V，中國有色金屬研究所，中國）制造。兔的人工膝關節由股骨髁假體和脛骨平臺假體及與其相連的髓內延長桿組成，關節面拋光。

1.3.3 抗菌測定 通過平板計數法評估AgO-TiO-NTS對革蘭陽性表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性。將細菌在牛肉提取物-蛋白胨（BEP）培養基中在攪拌下培養18 h，（37.0±0.5）℃。用BEP 稀釋至濃度為1.0×10CFU∕mL，將50 mL 細菌懸浮液加入每個樣品表面，共分為四組：1 mmol∕L組、2 mmol∕L 組、5 mmol∕L 組和10 mmol∕L 組。并將具有細菌懸浮液的樣品在（37.0±0.5）℃下在相對濕度＞90%的黑暗中溫育12 h。在孵育期結束時，將每個樣品在PBS中沖洗并超聲攪拌以從樣品中分離細菌。PBS中的活細菌通過標準連續稀釋和平板計數來定量。將樣品滅菌，超聲清洗，并在（37.0±0.5）℃下在10 mL PBS 中孵育6.5 d，每天更換PBS。使用細菌培養測定重新研究樣品。14 d 的抗菌活性：R＝（B-A）∕B×100%其中R是抗菌速率，B和A分別是TiONT（對照）和不同濃度AgO-TiO-NTS（樣品）上的活細菌（CFU）的平均數。

1.3.4 細胞培養及細胞毒性和細胞增殖 新西蘭大白兔膝關節軟骨細胞用于AgO-TiO-NTS 的生物學測定。將細胞在補充有10%小牛血清（CBS），100 U∕mL青霉素和100 mg∕mL鏈霉素的α-MEM中，在37 ℃，5%二氧化碳的濕潤氣氛中培養。當達到亞干擾時，通過溫和胰蛋白酶消化收獲細胞，離心，重懸于完全培養基中并重新接種。為了評估細胞增殖，細胞毒性和形態，將膝關節軟骨細胞以2×10個細胞∕cm的密度接種在樣品上。通過用于哺乳動物細胞的LIVE∕DEADO 活力∕細胞毒性試劑盒測定樣品的細胞毒性。通過MTT 方法定量評估細胞增殖和活力。在酶標儀（In fi nite F50，TECAN）上在570 nm和600 nm下測量吸光度。

1.3.5 白細胞計數、C反應蛋白（CRP）水平、降鈣素原（PCT）水平和紅細胞沉降率（ESR） 假體周圍感染通常會導致感染典型的實驗室檢查發生變化。指南建議確定CRP、PCT 水平和ESR。使用市售試劑盒細胞內PCT 和CRP 活性。THME-ESR2040 動態血沉分析儀檢測ESR，所有檢測均按儀器及試劑說明書規范操作。

2 結果

2.1 不同濃度的AgO-TiO-NTS 溶液菌落數及抗菌率比較

僅1 mmol∕L 和2 mmol∕L 兩組P＞0.05，其余5 mmol∕L 組和10 mmol∕L 組兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。隨著AgO-TiO-NTS溶液濃度的增加，抗菌率逐漸增加，10 mmol∕L AgO-TiO-NTS 溶液抗菌效果最強（32.34±1.75）CFU，故以10 mmol∕L Ag2O-TiO2-NTS 溶液制作表-Ag 釘組及金-Ag釘組的復合涂層并用于實驗（表1）。

表1 Ag2O-TiO2-NTS不同處理的新西蘭大白兔膝關節軟骨細胞培養菌落數和抗菌率統計

2.2 細胞毒性和細胞增殖

使用LIVE ∕DEADO 活力∕細胞毒性試劑盒定性測定Ag 釘的細胞毒性，結果顯示，表-Ag釘組、表-普釘組及金-Ag釘組和金-普釘組細胞死亡數目和細胞增殖數目差異無統計學意義（P＞0.05），說明AgO-TiO-NTS 沒有毒性且不影響細胞增殖，安全可靠。見表2。

表2 不同方法處理人工膝關節置換模型兔32只膝關節軟骨細胞毒性和細胞增殖∕（CFU，）

表3 不同方法處理人工膝關節置換模型兔32只肛溫水平比較∕（℃，）

表4 不同方法處理人工膝關節置換模型兔32只C反應蛋白（CPR）水平比較∕（mg∕L，）

表5 不同方法處理人工膝關節置換模型兔32只紅細胞沉降率（ESR）水平比較∕（mm∕h，）

表6 不同方法處理人工膝關節置換模型兔32只降鈣素原（PCT）水平比較∕（μg∕L，）

2.3 各組肛溫、CRP、ESR、PCT 水平比較

金-普釘組肛溫注射后10 d 最高（41.94±0.87）℃；金-普釘組CRP 注射后14 d 最高（91.95±6.47）mg∕L；金-普釘組ESR 注射后14 d 最高（70.13±4.47）mg∕L；金-普釘組PCT 注射后14 d 最高（2.58±0.54）μg∕L，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3～6。

2.4 不同處理組并發癥發生率和死亡率

表-Ag釘組與表-普釘組比較及金-Ag釘組與金-普釘組比較，并發癥發生率和死亡率，差異有統計學意義（P＜0.05），如表7所示。

表7 不同方法處理人工膝關節置換模型兔32只并發癥發生率和病死率比較∕%

3 討論

人工關節置換術后的并發癥對病人和治療它們的醫生構成了重大挑戰。例如，原發性膝關節置換術后的并發癥發生率為2%～10%。其中圍手術期關節假體周圍感染是第三大常見并發癥。根據最近的研究，初次全髖關節置換術的假體周圍感染的平均發生率為0.2%～2%。對于二次手術，它可以高達5%。關于感染發生率的數據根據人工關節的位置和類型（臀部＜1%，膝關節＜2%，肘＜9%，肩關節＜1%，巨型內置假體∕腫瘤內假體15%）和病人依賴因素而變化。假體周圍關節感染是人工關節二次手術的最常見原因之一（髖部15%，膝關節25%）。危險因素可分為以下幾組：病人依賴因素（如體質量過重，糖尿病，尼古丁∕酒精∕藥物濫用，營養不良），手術依賴因素（如手術時間延長），植入依賴因素（如巨型-假體），所有這些都增加了假體周圍關節感染的風險。引起假體周圍關節感染的最常見病原體是表皮葡萄球菌，金黃色葡萄球菌，鏈球菌，腸球菌和革蘭陰性菌。病原體可能在手術期間或之后進入關節，或者它們可以從相鄰的感染部位連續擴散到關節。

感染預防除了術前風險評估和風險最小化之外，感染預防包括快速，適當的手術，最大限度地減少手術風險，以及具有足夠經驗的手術團隊。治療優化可以降低長期成本并降低病人的風險。本研究中，AgO-TiO-NTS材料顯示較慢的Ag釋放，因為被TiO屏障包圍，從而減少Ag釋放引起的細胞毒性。我們的工藝沿著NT 的整個長度產生均勻分布的Ag NP，并且可以在一定范圍內調節摻入的Ag的量。AgO-TiO-NTS顯示出良好的抗菌特性和細胞相容性，并且在預防植入物相關感染方面具有良好效果。而且，NT-AgO陣列的制造工藝簡單，經濟且通用。盡管與其他的研究報道相比，AgO-TiO-NTS 中的Ag釋放顯著減少，但是AgO-TiO-NTS的長期抗菌能力仍能得到很好的維持。有人提出Ag的抗菌活性主要是釋放的Agb，它誘導細菌蛋白的失活，DNA的縮合和細菌細胞膜的降解。此外，據報道，Ag NPS與細菌之間的直接接觸會誘導質膜的結構變化和功能損傷，從而導致細胞溶質滲漏和細菌溶解。因此，AgO-TiO-NTS的抗菌活性源于釋放的Ag與Ag NP 直接接觸的協同作用。鑒于兩種抗菌機制，AgO-TiO-NTS可在植入物表面上產生持續的抗菌環境。應該注意的是，與其他研究相比，盡管在我們的抗菌測定中樣品表面引入的細菌較少，但實驗條件仍然比體內正常情況更為嚴酷。預計AgO-TiO-NTS 可以防止感染發生的有效時間比本研究證明的14 d更長。

確定AgO-TiO-NTS 是否具有良好的細胞相容性是有意義的。在我們的實驗中，從所有AgO-TiO-NTS 釋放的Ag的量遠低于所有普遍接受的人體細胞毒性濃度閾值。正如細胞實驗所證明的，AgOTiO-NTS對細胞的增殖和活力沒有明顯的有害影響。

綜上所述，AgO-TiO-NTS 通過TiAg 涂層的磁控濺射和陽極氧化產生。該材料由嵌入無定形TiO納米管壁中的結晶AgO NP 組成。AgO-TiO-NTS在體內外均對表面葡萄球菌及金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌作用，在治療骨關節假體相關性感染有良好前景。該技術可以擴展到其他功能性涂層和生物材料。