寺河礦15號煤層中產氫產乙酸微生物的富集和群落結構研究

肖 棟 元雪芳 段月嵐 李 進 Mohamed Keita，2Martial Le Prince Essengue Samboukel，2 何 環

(1. 中國礦業大學煤炭資源與安全開采國家重點實驗室，江蘇省徐州市，221116；2. 中國礦業大學礦業工程學院，江蘇省徐州市，221116；3. 煤與煤層氣共采國家重點實驗室，山西省晉城市，048000；4.徐州市第一人民醫院，江蘇省徐州市，221116；5.中國礦業大學化工學院，江蘇省徐州市，221116)

微生物法煤炭氣化開采是煤炭流態化開采技術方法之一[1]。伴隨采礦深度的增加，地溫升高、地壓增大，以及煤層水文地質條件復雜[2]、煤炭運輸成本增加等難題成為限制超深煤層開采的關鍵影響因素[3]。

煤層微生物的活動需要溫度較高、物質豐富的水資源，且微生物的耐壓能力較強[4]，這使得煤炭生物氣化技術能夠極好地適應超深煤層地質條件[5]；所以利用微生物對煤中有機質進行降解，在地下煤層中可將固態資源轉化為氣態資源[6]。而且，煤炭氣化開采能夠解決固態煤炭運輸成本高的難題。因此，煤炭生物氣化的技術發展可以為超深煤層常規開采難的問題提供一種有效的技術解決方法。

產甲烷微生物菌群是實現煤炭微生物氣化的關鍵菌群[7]，當前產甲烷菌群對煤的降解關鍵特征、生物群落結構[8]、菌群的培育與誘導方法等研究相繼展開[9]。研究結果表明，多數煤地質產甲烷菌以乙酸發酵型產甲烷菌為主，部分煤層伴有二氧化碳還原性菌種[10]。關于對乙酸代謝途徑的煤的生物降解特征研究證實，煤炭發酵過程是由水解菌群、發酵菌群、產乙酸菌群和產甲烷菌群等功能性微生物類群共同作用完成[11]。

產乙酸菌是自然界普遍存在的一類微生物，主要以水溶性糖類物質、蛋白質水解產物、小分子酸、醇類等碳水化合物為碳源[12]，通過生物代謝產生乙酸的微生物。乙酸菌的代謝特點是以質子作為唯一的電子受體，所以進行的大多數氧化反應在標準熱力學狀態下是吸能的[13]，該菌種的生長需要較高的環境溫度，其代謝產物的集聚對菌群的生長和代謝具有抑制作用[14]。在產甲烷菌群系統中，產甲烷菌和硫酸鹽還原菌與產乙酸菌形成共生關系[15]，并且在營養傳遞鏈中產甲烷菌和硫酸鹽還原菌位于產乙酸菌之后，它們對乙酸的消耗降低了乙酸聚集對乙酸菌的抑制作用[16]。共生關系對保持煤層地質產甲烷菌群中乙酸菌的活性能夠起到至關重要的作用，由此，煤層地質微生物群中產乙酸特征菌屬的多樣性研究為進一步開展煤層地質產甲烷微生物群落代謝途徑與代謝組學研究具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 實驗菌群和煤樣

本項研究所采用的產甲烷菌群取自山西晉城無煙煤礦業集團有限責任公司寺河礦。礦區位于沁水煤田東南邊緣，礦井面積約為230 km2，南北走向長約為12 km，東西傾斜寬約為23 km，地質儲量為15億t。井田主采煤層分為3號、9號和15號煤層，總厚度為10.32 m。煤種為低硫、低-中灰、高發熱量、高機械強度的無煙煤[17]。其中，15號煤層已證實存有休眠狀態的產甲烷微生物群，并成功利用該煤層菌群實現煤的生物氣化試驗[18]。本次實驗用菌群來自15號煤層，取掘進頭新揭露塊狀煤樣為本次實驗富集菌群所需樣品，煤樣采集一是取塊體短邊不小于150 mm，二是取樣位置未受注水等作業影響，三是煤樣需從新揭露煤壁采用掏槽法取樣，四是取樣過程避免供風直吹、水淋、肢體直接接觸等環境污染。新取煤樣快速置入無菌自封袋，并采用氮氣吹掃，減少煤樣與空氣接觸、保持煤樣處于厭氧狀態。煤塊在實驗室氮氣保護下破碎，塊體粒度為5～10 mm，破碎后的塊體采用氮氣保護并置于4 ℃的冷藏箱中待用。

1.2 培養基配置與實驗裝配

實驗中設置了3種培養基，分別是牛肉膏蛋白胨培養基(BP：牛肉膏為3 g/L、蛋白胨為10 g/L、NaCl為10 g/L)[15]、馬鈴薯淀粉葡萄糖培養基(PSG：馬鈴薯淀粉為200 g/L、葡萄糖為20 g/L、酵母抽提物為0.5 g/L)[19]、葡萄糖小分子酸培養基(GSMA：葡萄糖為20 g/L、酵母抽提物為0.5 g/L、甲酸鈉為6.8 g/L、乙酸鈉為8.2 g/L)。3種培養基各配置1200 mL，配置好的培養基用0.1 mol/L的NaOH調節pH至7.0。

BP培養基是一種應用十分廣泛的天然培養基，在前期試驗中該培養基能夠成功對煤層產甲烷菌群實現活化[18]。BP培養基中的牛肉膏能夠為微生物提供碳源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，NaCl提供無機鹽；PSG培養基以PDA培養基為基礎去除瓊脂組分后完成配置，其中馬鈴薯淀粉為微生物提供碳源和多種營養，葡萄糖提供碳源、酵母提取物提供微量元素與生長因子[19]；GSMA培養基由葡萄糖提供主要碳源，酵母提取物提供微量元素與生長因子，乙酸鹽和甲酸鹽模擬乙酸菌代謝產物，提高溶液中代謝產物濃度，增加干擾設置，培養基配置中，甲酸鈉與乙酸鈉采用相同的摩爾濃度配置(0.1 mol/L)。每升培養基中加入W/V 為0.1%的刃天青1 mL作為厭氧指示劑，該指示劑在氧化還原電位為100 mV以上時顯示藍色，隨著氧化還原電位的降低，逐漸轉為淡粉色，當氧化還原電位達到-40 mV以下時顯示無色[20]。配置好的培養基采用上海申安醫療器械廠生產的型號為LDZF-75KB立式壓力蒸汽滅菌器進行滅菌，BP培養基采用1.05 kg/cm2的壓力，在121℃和20 min內滅菌2次，PSG培養基和GSMA培養基采用1.05 kg/cm2的壓力，在111℃和20 min內滅菌2次(溫度設置為111℃是為了防止葡萄糖高溫分解)。滅菌后培養基采用氮氣保護冷卻至室溫，移至英國DWS公司生產的型號為DG500的厭氧培養箱中備用。

實驗采用500 mL的血清瓶為培育器皿。將21個滅菌后的血清瓶進行標記，然后根據標記分別在厭氧培養箱中分裝3種培養基，每瓶200 mL。每種培養基設置5個平行樣、2個無菌樣。3種培養基的5個平行樣中添加煤塊5.0±0.1 g，厭氧培養箱中用基丁膠塞密封，并用鋁蓋封口。裝配完成的試樣放入恒溫震蕩培養箱內40℃避光培養，震蕩速度設置為80 rpm。

1.3 產乙酸菌群產氣和產酸特征分析

實驗中采用注射器對各實驗樣品的產氣量進行周期測定，容積產氣率見式(1)：

(1)

式中：VLRin——第i個培養單元第n次容積產氣率，L/(L·d)；

Vin——1 atm條件下第i個培養單元第n次測試產氣總體積，mL；

Vvi——第i個培養單元培養基總量，mL；

Tin——第i個培養單元第n次測試時的時間點，h；

Ti(n-1)——第i個培養單元第n-1次測試時的時間點，h。

排出混合氣樣中的H2、CO2和CH4含量測定采用安捷倫7890A氣相色譜儀進行，色譜柱為Agilent Carbonplot(60 m×320 μm)，載氣為高純氮氣(99.999%)，填充柱進樣口溫度為150℃，隔墊吹掃流量為3 mL/min，進樣量為500 μL，柱箱溫度為25℃，保持7.5 min，采用TCD檢測器檢測溫度為200℃，參比流量為400 mL/min，尾流量為8 mL/min。H2的出峰時間為3.2 min，CH4的出峰時間為3.7～4 min，CO2的出峰時間為4.4 min。

甲酸、乙酸、丙酸等揮發性小分子酸采用氣相色譜-質譜聯用儀測定，該設備由安捷倫7890A氣相色譜儀與5975C質譜儀組成。色譜柱采用VF-WAXms色譜柱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。程序升溫設置如下：初始溫度為80℃，以10℃/min的速率升溫至100℃后保持3 min，以15℃/min升溫至150℃后保持5 min，再以運行溫度為250℃保持5 min。進樣口為無分流模式，溫度為280℃，吹掃速率為15 mL/min，吹掃時間為0.2 min。載氣為99.999%的高純度氦氣，柱流速為1.0 mL/min。

BP、PSG培養基中小分子酸測試時，混合標樣中3種酸的質量比如下：甲酸∶乙酸∶丙酸=1∶1∶1。測試中首先對標樣進行測試，得到不同酸的出峰時間和峰高，獲得3種小分子酸的線性關系，然后測試樣品。

GSMA培養基中小分子酸測定時，混合標樣設計為“3種酸+2種鹽”，質量比∶甲酸∶乙酸∶丙酸∶甲酸鈉∶乙酸鈉=1∶1∶1∶1∶1。測試中首先對標樣進行測試，得到不同酸以及鹽的出峰時間和峰高，獲得不同酸與鹽的線性關系，然后測試樣品，以排除培養基中甲酸鈉和乙酸鈉對測試結果的影響。

1.4 淀粉與還原糖檢出測定

采用碘-碘化鉀溶液檢測培養基中是否含有淀粉。稀釋后的碘-碘化鉀溶液與淀粉作用時，會形成碘化淀粉，并呈藍色的特殊反應，淀粉的水解物糊精遇碘變紅。測試時，用移液器于各平行樣取培養液1 mL加入小試管，滴入標準碘-碘化鉀溶液，根據變色反應，測定培養基中是否含有淀粉。

采用本尼迪特試劑測定培養基中是否含有還原糖。還原糖環境中，本尼迪特試劑中的CuSO4中的Cu2+被還原成Cu+，并以Cu2O的形式沉淀出來。如果溶液中還原糖含量較低，產生的Cu2O相應減少，試驗后會出現綠色、混濁的黃色或橙色沉淀物。測試時，用移液器于各平行樣取培養液2 mL加入小試管，加入1 mL標準本尼迪特試劑，搖勻后將此混合物在沸水中加熱，反應時間3 min。根據變色反應，測定培養基中是否含有還原糖(葡萄糖等)。

1.5 產乙酸菌群的群落結構分析

產氣產酸實驗中，每種培養基平行樣各抽取10 mL混合后至于100 mL無菌離心管中，以此每種培養基共獲取50 mL菌液作為菌樣。利用冷凍離心機12000×g離心10 min，倒掉上清液，收集離心管內的菌沉淀在溫度為-20℃的條件下凍存用于提取DNA。DNA提取方法采用寶生物工程(大連)有限公司水樣DNA提取試劑盒提取方法進行，檢測委托上海美吉生物科技有限公司完成。收集的菌樣用小型珠磨式研磨器破碎，經SDS與Proteinase K消化、酚-氯仿抽提、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌沉淀后，加入滅菌雙蒸水溶解沉淀得到微生物總基因組DNA。0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取基因組DNA 的長度及完整性。

提取的基因組DNA作為模板進行細菌16SrRNA 基因V1-V3 區片段的擴增。PCR擴增引物采用21F、1492R(21F:5′-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3′、1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)。擴增條件為94℃預變性5 min，隨后以94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min；72℃保溫10 min進行30個循環。最后將擴增產物凍存，委托廣州賽哲生物科技有限公司完成高通量測序與數據分析。

1.6 產甲烷菌的鑒定

試驗中采用熒光顯微鏡觀察法對培育系統中是否含有產甲烷菌進行鑒定。產甲烷菌在420 nm紫外光激發下產生藍-綠色熒光[18]。該檢測方法利用了產甲烷菌細胞中含有輔酶F420和甲基喋呤類化合物具備420 nm紫外照射下具備熒光激發這2個特征[21]。目前除了甲烷菌外還未發現其他厭氧菌具備這一特征，因此420 nm熒光檢測是作為產甲烷菌鑒定的重要方法。

2 結果與分析

2.1 產乙酸菌富集培育過程中產乙酸量和pH變化

試驗中采用BP培養基、PSG培養基、GSMA培養基這3種培養基對煤樣中的產乙酸菌進行培育。培育溫度為40℃、振蕩頻率為80 rpm。每種培養基設置空白樣2個。試驗中任何一個空白樣出現產氣或刃天青變色均判定為實驗污染，重復實驗。實驗中分別在第5天和第10天對培養基中的淀粉、還原糖、3種小分子酸(甲酸、乙酸、丙酸)濃度和培養液酸堿度進行測定。測試完成每種培養基5個平行數據中取結果最接近的3組數據取平均值計為本次測試結果。

首先從培養基的利用情況分析，采用碘-碘化鉀溶液和本尼迪特試劑對培育5 d后3組培育組是否含有淀粉與還原糖進行了測定，產乙酸菌富集培育過程中3種培養基中淀粉與還原糖含量測定見表1。

由表1可以看出，淀粉檢測中BP、GSAM呈陰性，PSG呈陽性。即培育后第5天，PSG中的淀粉未被完全水解。還原糖檢測中，BP、PSG 、GSAM這3種培養基均呈陽性。該結果證明，BP培養基中的部分營養物質被水解為還原糖，PSG、GSMA中仍存在一定量的還原糖未被完全降解。

表1 產乙酸菌富集培育過程中3種培養基中淀粉與還原糖含量測定

小分子酸與pH測試結果表明，3種培養基自第5天，均測到一定濃度的乙酸，伴隨培育時間的增長，乙酸濃度總體呈增長趨勢，各組均未檢測到甲酸與丙酸。培育后第5天，PSG培養基中乙酸濃度最高，達到120.10 mmol/L；其次為GSM培養基，乙酸濃度為87.53 mmol/L；BP培養基的乙酸濃度變化最小，乙酸濃度僅為19.61%。3種培養基中酸堿度變化與乙酸濃度成正比，3種培養基pH酸性特征順序為PSG(pH=5.1)、GSM(pH=6.2)、BP(pH=6.9)。

培育第10天，對培養基中淀粉、還原糖、小分子酸、pH值進行了第2次測定。首先淀粉與還原糖分析結果如下：淀粉檢測結果表明，BP、PSG、GSAM均呈陰性，即培育后第10天，PSG中的淀粉完全水解。還原糖檢測結果表明，BP呈陽性(顏色呈綠色)，PSG 、GSAM培養基均程陰性。該結果證明，BP培養基中含有少量還原糖，PSG、GSMA中的還原糖已被完全降解。

乙酸測試結果表明，經過10 d的培育，乙酸濃度最高的培育組依然是PSG培養組，乙酸濃度達到231.26 mmol/L，乙酸增長率為92.56%；其次為GSM培育組，乙酸濃度上升至152.49 mmol/L，乙酸增長率為74.21%；BP培養基乙酸濃度則為25.47 mmol/L，該培養基中乙酸增長率為29.88%。 此時，3種培養基的酸堿度分別為BP(pH=6.5)、PSG(pH=3.8)、GSMA(pH=4.3)。3種培養基培育實驗第5天和第10天各組乙酸含量和pH變化如圖1所示。

3組培養基2次測試結果表明，馬鈴薯淀粉葡萄糖培養基(PSG培養基)獲得最佳的乙酸富集，葡萄糖小分子酸培養基(GSMA培養基)的最終乙酸濃度為PSG最終濃度的65.93%，相對而言，BP培養基未成功獲得顯著的乙酸富集。

圖1 3種培養基培育實驗第5天和第10天各組乙酸含量和pH變化

培養基中乙酸濃度的變化能夠間接反應產乙酸菌是否被富集。由于乙酸是有機質代謝產甲烷的關鍵中間產物，當乙酸菌與具有乙酸降解特征的產甲烷菌等共同生長時，培養基中乙酸濃度變化將不顯著。試驗中的BP培養基對煤中微生物群進行培育時即出現該類情況，3種培養基對產氫產乙酸菌富集培育第5天和第10天培養基菌群鏡檢如圖2所示。

由圖2(a)和圖2(f)可以看出， BP培育組第5天和第10天培養基試樣在420 nm紫外線照射下能夠觀測到藍綠色光斑，圖中每個藍綠光斑為單個或多個產甲烷菌，證明BP培養基培育被同步培育。利用圖像提取反相處理后，圖2(a)和圖2(f)中的藍綠光斑以黑色斑點展現在白色背景中，對比圖2(b)和圖2(g)，結合圖2(c)和圖2(h)首先能清晰觀測到代表產甲烷菌數量的斑點/斑塊數量變化與總菌群群落數量變化的趨勢關系，由此證實BP培育系統中的產甲烷菌從培育第5天到培育第10天與其他菌種共同增長，并被顯著富集。

由圖2(d)、圖2(e)、圖2(i)和圖2(j)可以看出，PSG和GSMA培育組中菌種數量伴隨培育時間增加，并同樣呈現顯著增長趨勢，但是熒光觀測未發現產甲烷菌。

這一結果證明，BP培養基實現對乙酸菌等菌種培育的同時，也實現了對產甲烷菌的培育。

2.2 產乙酸菌富集過程中的產氫規律

產乙酸菌發酵過程中有2種類型菌種，一種是產氫產乙酸菌，另一種是不產氫產乙酸菌，2種菌種具備相同的產乙酸特性，但是產氣特征不同。為深入觀測寺河礦15號煤層產乙酸菌種是否具備產氣特征，試驗中每天對各培育組的容積產氣率進行了測定與統計，各培育組實驗期間H2、CO2、總容積產氣率與累積容積產氣率變化曲線如圖3所示。

圖2 3種培養基對產氫產乙酸菌富集培育第5天和第10天天培養基菌群鏡檢

圖3 3組培養基實驗期間H2、CO2、總容積產氣率與累積容積產氣率變化曲線

容積產氣率測定表明，PSG與GSMA培養基均在第2天產氣， BP培養基在培育后第4天開始產氣，產H2過程中均伴生CO2氣體。生物成氣組分中，PSG培養組產氣中的H2平均體積濃度為56.63%，GSMA培育組產氣中H2濃度略低，其體積濃度為53.25%。培育期間， BP組總產氣率最低。實驗結束時，該實驗組產氣正處于緩慢升高階段。

對該實驗組分析中發現，生物成氣組分中H2體積濃度保持在8%以下，CO2平均體積濃度為55.29%，除此之外該培養組產氣中測得CH4濃度平均為36.71%。試驗中PSG和GSMA分別在第9天和第8天停止產氣。生物產氣過程停止原因如下所述。

(1)各培養基中的碳源是乙酸菌代謝基礎，培育終點通過淀粉與還原糖檢出實驗證明，PSG培養基中的淀粉已被完全水解，并且PSG與GSMA中的還原糖被充分利用，因此培養基底物的匱乏是導致生物成氣停止的原因之一。

(2)常規培育實驗認為，培育系統的pH值低于4.5時，會出現酸抑制，并且隨著酸性的增加，抑制效果更加明顯。至培育終點，PSG培養基的pH為3.8，GSMA培養基的pH為4.3，培養系統偏酸，抑制了產氫產乙酸菌活性。

試驗中，PSG培育組最大容積產氣率出現在第6天和第7天，容積產氣率達到1.11 L/(L·d)，在第2天到第6天內，容積產氣率一直處于上升階段，此階段也是產氫產乙酸菌的快速生長階段，實驗結束，該培育組最大累積容積產氣量為4.83 L/L；GSMA最大容積產氣率出現在第4天到第6天，容積產氣率為0.72 L/(L·d)，第2天到第4天是該培養基產氣上升期，該組培育中最大累積容積產氣量為2.95 L/L。

2.3 各培育組菌群結構分析

實驗中分別在第5天和第10天對3種培育條件下培育系統中的生物多樣性進行了測定，對豐度在0.1%以上的菌種進行了統計。高通測序結果表明，伴隨培育時間的增長，各培育系統中的菌種多樣性呈遞減的趨勢發展，并且不同培養基的不同菌種的富集效果不同。其中富集效果最好的是PSG培養基，該培養基能夠很好的實現對TerrisporobacterSP.的富集。培育5 d時，培育系統豐度大于0.1%的菌屬為CitrobacterSP.、TerrisporobacterSP.和EnterococcusSP.等。經過10 d培育后，該培養組富集出TerrisporobacterSP.菌屬，相對豐度大于98%。3種培育方式對寺河煤層產氫產乙酸菌富集中生物多樣性的變化如圖4所示。

圖4 3種培育方式對寺河煤層產氫產乙酸菌富集中生物多樣性的變化

BP培育組在培育后第5天，豐度大于0.1%的菌屬有9種，培育終點，該組培養基主要完成富集的菌屬包括BacteroidesSP.、CitrobacterSP.、CupriavidusSP.、TerrisporobacterSP.和DysgonomonasSP.，共計5種；GSMA培育組第5天的菌屬測序中，豐度大于0.1%的菌屬為Citrobacter SP.、ClostridiumSP.、EnterococcusSP.、LachnoclostridiumSP.、ParaclostridiumSP.、TerrisporobacterSP.共計6種，經過10 d培育后，ClostridiumSP.、EnterococcusSP.、LachnoclostridiumSP.和TerrisporobacterSP.等4種菌屬被富集。

通過菌種多樣性伴隨培育時間的變化分析，首先BP、PSG、GSMA這3個培育組中均培育了TerrisporobacterSP.菌屬。據文獻記載，TerrisporobacterSP.為嚴格厭氧發酵菌，可以利用各種糖、蛋白質、有機酸作為底物[22]，乙酸是該菌屬的標志性產物，并且代謝中伴隨H2和CO2生成[23]，純化培育中，該細胞呈桿狀。本實驗所富集的菌株具有顯著的產氣能力，氣體產物以H2和CO2為主，H2濃度大于50%。根據培養基組分，該菌株具備將還原糖轉化為乙酸的特性。由于在培育前5天，培養基中處于淀粉、葡萄糖和淀粉水解產物復合狀態，并且菌群中除了TerrisporobacterSP.菌屬外，還包含CitrobacterSP.、EnterococcusSP.等，因此本次試驗中無法確定該菌種是否會釋放胞外淀粉酶淀粉水解酶。但根據后5天菌種的富集結果，該菌種在PSG營養條件下具有利用還原糖為營養的快速生長能力，并且對其他周圍的菌種具有較強的抑制性，從而使該菌種能在培育期間快速形成優勢菌種。

其次，GSMA培育中，除TerrisporobacterSP.之外，還富集了ClostridiumSP.、EnterococcusSP.、LachnoclostridiumSP.等3種。其中EnterococcusSP.是一種革蘭氏陽性兼性厭氧發酵菌，外形呈球狀，又名腸球菌。該菌種多以雙球或短鏈形式存在，代謝中產酸、產氫特征不顯著[23]；ClostridiumSP.為梭狀芽胞桿菌屬桿狀細菌(見圖4)、多數菌種為革蘭氏陽性厭氧菌，該菌種廣泛分布于土壤、淡水、海洋沉積物以及動物的腸道中。菌種大小根據種類不同差異較大，從0.6～3 μm，最長7 μm。ClostridiumSP.菌屬中的某些菌株的能夠利用H2和CO2產生乙酸[24]。LachnoclostridiumSP.嚴格厭氧發酵桿菌，具備發酵糖類物質并轉化為乙酸的代謝特征，代謝中產氣特征不顯著[25]。

綜合各組培育方法、乙酸富集、產氣特征分析，PSG培養基富集了TerrisporobacterSP.菌屬，GSMA富集了TerrisporobacterSP.、EnterococcusSP.、LachnoclostridiumSP.這3種菌屬，由此證明了寺河礦煤層地質微生物群中產乙酸特征菌是由多種產乙酸菌構成的菌群，該菌群具備利用還原糖等碳水化合物產生乙酸的代謝。除此，菌群中還存在有類似ClostridiumSP.菌屬，可以利用產氫產乙酸菌的代謝產物H2和CO2生成乙酸，以生物合成的方式提高系統乙酸濃度。結合GSMA培養基與PSG培養基，在培育系統中存在乙酸鹽和甲酸鹽情況下，對TerrisporobacterSP.菌屬的競爭具有一定抑制作用，該條件下能夠獲得除TerrisporobacterSP.菌屬之外的多種具有產乙酸特征菌種的富集。BP培養基提供了更為均衡的營養，該條件下產甲烷菌群能夠獲得一定程度的生長(PSG和GSMA中均為通過熒光顯微鏡觀察到產甲烷菌)，但是該培育條件下不利于產乙酸菌的富集。

3 結論

研究中首選利用3種不同碳結構培養基對寺河礦15號煤層中的產氫產乙酸菌進行了為期10 d的培育。培育中選取第5天和第10天分別對培養基中乙酸含量、酸堿度水平、淀粉與還原糖存在狀態以及生物多樣性進行了測定，同時培育中對每個平行樣每天容積產氣率進行了跟蹤測定。綜合以上因素，本試驗研究結果如下所述。

(1)不同培養基對寺河礦15號煤層產氫產乙酸菌產生不同的培育結果。其中BP培養基基本保持了原煤地質微生物菌群所具備的產甲烷特征，未能富集產氫產乙酸菌。PSG與GSMA培養基各自實現具備菌種結構特征的產乙酸特征菌的富集。

(2)PSG培養基實現了對TerrisporobacterSP.菌屬的富集，該菌屬具備利用還原糖產乙酸的特征，H2和CO2是該菌株的代謝伴生產物。經10 d培育，培養基中的淀粉與葡萄糖均被降解。

(3)GSMA培育結果證實，甲酸鈉和乙酸鈉對TerrisporobacterSP.菌屬形成優勢菌屬具有抑制性，該培養基培育條件下完成對ClostridiumSP.、EnterococcusSP.、LachnoclostridiumSP.和TerrisporobacterSP.等4種菌屬的富集。其中TerrisporobacterSP.菌屬具備典型的產氫產乙酸特征；LachnoclostridiumSP.菌屬不具有產氫產乙酸特征；而ClostridiumSP.菌屬則具有利用其它菌種代謝生成H2和CO2的特征，以及通過代謝合成生成乙酸的能力。3種菌屬在具備產乙酸特征的同時，又各自具有獨特的代謝方式。

(4)產乙酸菌的富集證明，寺河礦15號煤層中存有不止一種屬種的產乙酸菌，并且部分菌種代謝中具備顯著的產H2和CO2特征，還存有菌屬可以利用H2和CO2產生乙酸。而BP實驗組的生物多樣性與產氣特征有待進一步證實，寺河礦煤層中的產甲烷菌群具備乙酸降解型發酵特征，從PSD與GSMA富集菌種的代謝產氣特征表明，煤層中除乙酸發酵性產甲烷菌外，還存有二氧化碳還原性產甲烷菌的可能性。