家禽糞便環境對常用消毒劑滅活H5N6亞型禽流感病毒的影響

秦濤，汪川韋，鄭淑媚，張佳琦，朱閩，陳素娟，彭大新

(揚州大學獸醫學院/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009)

在2010年以前，我國主要流行的是H5N1亞型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)，而2010年之后，家禽中又陸續出現了H5Nx亞型AIV的流行[1-3]。自2013年以來，H5N6亞型高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)已逐漸取代H5N1亞型HPAIV成為目前我國家禽主要流行株[4-5]。另外近年來有感染人的事件發生，嚴重威脅著公共衛生健康。疫苗接種雖能有效地控制HPAIV，但是在抗體選擇壓力下，病毒的變異速度加快，導致疫苗的免疫效果失敗，因此僅僅依賴疫苗并不是最有效的防控手段[6]。很多學者及從業者逐步認識到養禽場和活禽交易市場的防疫核心仍然是生物安全體系的建設，其中消毒技術體系是最基礎但最不容忽視的環節。養禽場和活禽交易市場存欄禽規模較大，產生的糞便體量較大，特別是活禽交易市場，存在環境和器具等清潔不徹底導致糞便殘留等問題。H5N6亞型AIV主要通過糞口途徑傳播，糞便排毒常見，可見如何保障有效殺滅家禽殘留糞便中的病毒是阻斷傳播的關鍵。但按照常用消毒劑說明書的推薦濃度是否能有效殺滅病毒目前尚不明確。因此，本試驗在家禽糞便環境下評估了5種常用的化學消毒劑對我國H5N6亞型HPAIV流行株的滅活效果，為科學合理地選擇養禽場和活禽交易市場消毒劑種類和劑量提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與毒株

犬腎細胞(madin-darby canine kidney，MDCK)培養于含10%胎牛血清的DMEM中。A/Goose/Anhui/AHG0419/2016(H5N6)禽流感病毒，由揚州大學農業部畜禽傳染病學重點開放實驗室動物生物安全三級實驗室分離、鑒定并保存。

1.2 主要試劑

5種消毒劑分別為：過硫酸氫鉀復合物、二氯異氰脲酸鈉、戊二醛癸甲溴銨、癸甲溴銨和戊二醛苯扎溴銨。按照說明書，過硫酸氫鉀復合物的推薦濃度：針對AIV的使用濃度為0.062 5%，法氏囊病毒的使用濃度為0.25%，水產養殖的使用濃度為0.5%。疫源地消毒時，二氯異氰脲酸鈉的推薦使用濃度為0.2 g/L，戊二醛癸甲溴銨的推薦使用濃度為0.2%～0.1%，癸甲溴銨的推薦使用濃度為0.015%～0.05%，戊二醛苯扎溴銨的推薦使用濃度為1%。所有消毒劑使用的標準硬水(硬度342 mg/L)[7]，由氯化鎂(MgCl2·6H2O，0.139 g)和氯化鈣(CaCl2，0.034 g)加蒸餾水至1 L配制。

各消毒劑所對應的中和劑[8]：過硫酸氫鉀復合物和二氯異氰脲酸鈉的中和劑為0.2 mol/L硫代硫酸鈉(國藥集團)；戊二醛癸甲溴銨的中和劑為0.1%甘氨酸(Biosharp)+0.3%吐溫80(BioFRoxx)；癸甲溴銨的中和劑為0.1%甘氨酸+0.3%吐溫80+0.03%卵磷脂(國藥集團)；戊二醛苯扎溴銨的中和劑為0.05%甘氨酸+0.4%吐溫80。

1.3 中和劑鑒定試驗

1.3.1 中和劑及中和產物對H5N6亞型AIV在MDCK細胞中增殖的影響

依據衛生部頒布的《消毒技術規范》[7]，評估糞便、中和劑及中和產物對病毒滴度的影響。試驗共分為9組：第1組是消毒劑+病毒懸液；第2組是(消毒劑+病毒懸液)+中和劑；第3組是中和產物(消毒劑+中和劑)+病毒懸液；第4組是(硬水+病毒懸液)+中和劑；第5組是(硬水+病毒懸液)+PBS；第6組是(糞便+硬水+病毒懸液)+中和劑；第7組是(糞便+硬水+病毒懸液)+雙抗PBS；第8組是(硬水+病毒懸液)+硬水+雙抗PBS；第9組是硬水+PBS，作為不接病毒對照組。試驗結果評判標準：第1組無試驗病毒或有少量病毒；第2組較第1組為病毒稍多或相近數量，但較第3、4、5、6、7和8組顯著減少；第3、4、5、6、7和8組病毒數量與原接種量相近，第9組細胞生長正常。每組試驗重復3次。

1.3.2 病毒滅活試驗

依據衛生部頒布的《消毒技術規范》[7]，用標準硬水將消毒劑配制為雙倍濃度，吸取溶液0.5 mL于2個離心管中，置25℃水浴中5 min，再分別吸加0.5 mL病毒懸液(新鮮家禽糞便與尿囊液1∶1混勻后，25 ℃水浴鍋中放置30 min)，混勻并放回25℃水浴鍋。待作用一定時間(10 min、30 min、60 min)后，立即取出0.1 mL，加入含有雙抗的中和劑0.9 mL，混勻，作用30 min后，進行10倍系列稀釋(101～108)，接種于MDCK細胞，37℃、5% CO2培養箱中培養，病毒的半數細胞感染劑量(TCID50)按照Reed-Muench法進行計算，平均滅活對數值按下式計算：設陽性(病毒)對照組平均TCID50的為N0，試驗(消毒)組平均TCID50為Nx，平均滅活對數值=lgN0-lgNx，當平均滅活對數值=lgN0時，視為病毒完全滅活。試驗重復3次。

2 結果

2.1 中和劑及中和產物對病毒滴度的影響

前期研究發現本試驗所用的4種中和劑及其中和產物不影響MDCK細胞的生長狀況[9]。采用的9組試驗方案結果表明，含0.4 mol/L的硫代硫酸鈉雙抗PBS可以有效中和1%過硫酸氫鉀復合物溶液以及3.2 g/L二氯異氰脲酸鈉溶液；含0.6%吐溫80+0.06%卵磷脂+0.2%甘氨酸的雙抗PBS可以有效中和 0.24%癸甲溴銨溶液；含0.6%吐溫80+0.2%甘氨酸的雙抗PBS可以有效中和2%戊二醛癸甲溴銨溶液；含0.8%吐溫80+0.1%甘氨酸的雙抗PBS可以有效中和0.8%戊二醛苯扎溴銨溶液；與病毒陽性對照組對比，加入中和劑及中和產物后，對病毒的滴度影響較小(見表1)。

表1 中和劑及中和產物對病毒滴度(TCID50)的影響 lg

2.2 糞便環境對過硫酸氫鉀復合物殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無糞便環境下(對照組)，0.2%過硫酸氫鉀復合物溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對數值為5.17±0.17)；在糞便環境下，該消毒劑需提高2.5倍用量，0.5%作用10 min才能將病毒完全殺滅(滅活對數值為5.42±0.09)(見表2)。

表2 在不同環境下過硫酸氫鉀復合物溶液對H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.3 糞便環境對二氯異氰脲酸鈉殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無糞便環境下，濃度為0.4 g/L二氯異氰脲酸鈉溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對數值為5.50±0.00)；在糞便環境下，該消毒劑需提高2倍用量，0.8 g/L濃度作用10 min才能將病毒完全殺滅(滅活對數值為5.25±0.25)(見表3)。

表3 在不同環境下二氯異氰脲酸鈉溶液對H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.4 糞便環境對戊二醛癸甲溴銨殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無糞便環境下，0.25%戊二醛癸甲溴銨溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對數值為4.75±0.25)；在糞便環境下，該消毒劑需提高4倍用量，1%作用延長至30 min才能將病毒完全殺滅(滅活對數值為4.67±0.00)(見表4)。

表4 在不同環境下戊二醛癸甲溴銨溶液對H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.5 糞便環境對癸甲溴銨殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無糞便環境下，0.015%癸甲溴銨溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對數值為5.17±0.25)；在糞便環境下，該消毒劑需提高8倍用量，0.12%作用延長至30 min才能將病毒完全殺滅(滅活對數值為5.13±0.24)(見表5)。

表5 在不同環境下癸甲溴銨溶液對H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

2.6 糞便環境對戊二醛苯扎溴銨殺滅H5N6亞型AIV的影響

在無糞便環境下，0.1%戊二醛苯扎溴銨溶液作用10 min可以將H5N6亞型AIV完全殺滅(滅活對數值為5.09±0.42)；在糞便環境下，該消毒劑需提高4倍用量，0.4%濃度作用10 min才能將病毒完全殺滅(滅活對數值為5.25±0.25)(見表6)。

表6 在不同環境下戊二醛苯扎溴銨溶液對H5N6亞型AIV的滅活效果 lg

3 討論

本研究選擇了5種養殖場常用的消毒劑，評估在糞便環境下對各種消毒劑殺滅目前流行的H5N6亞型HPAIV的影響。結果表明，這5種消毒劑均受到家禽糞便環境的影響。與無糞便環境對比，殺滅糞便中H5N6亞型HPAIV，過硫酸氫鉀復合物溶液作用濃度需提高2.5倍，二氯異氰脲酸鈉溶液作用濃度需提高2倍，戊二醛癸甲溴銨溶液作用濃度需提高4倍，癸甲溴銨溶液作用濃度需提高8倍，戊二醛苯扎溴銨溶液作用濃度需提高4倍。相較而言，過硫酸氫鉀復合物溶液、二氯異氰脲酸鈉溶液受糞便的影響較小；戊二醛癸甲溴銨溶液與戊二醛苯扎溴銨溶液受糞便的影響較大，癸甲溴銨溶液受糞便的影響最大。與各消毒劑最大推薦濃度相比，過硫酸氫鉀復合物溶液、二氯異氰脲酸鈉溶液、戊二醛苯扎溴銨溶液在糞便環境下均可以有效滅活H5N6亞型HPAIV，而癸甲溴銨溶液、戊二醛癸甲溴銨溶液在糞便環境下均不能有效滅活H5N6亞型HPAIV，使用時需提高至最大推薦濃度以上。銀濤等[10]在對戊二酸消毒劑滅菌效果研究發現，通過添加有機物來影響消毒劑消毒效果，隨著消毒劑濃度的降低，有機物影響效果越明顯。糞便可以吸附并且中和消毒劑，阻礙了與病毒的直接接觸，從而顯著降低了消毒劑的活性，影響消毒效果。因此對于糞便殘留物的消毒，應選用穿透力和氧化性強的消毒劑，例如二氯異氰脲酸鈉溶液等。