胸膜肺炎放線桿菌對四環素類抗生素的耐藥分析及相關基因檢測

李海利，朱文豪，張青嫻，游一，方劍玉，焦文強，徐引弟，許峰，王治方，郎利敏，張立憲，王克領

(河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002)

豬傳染性胸膜肺炎是危害養豬業的一種嚴重的呼吸道疾病，在規?；B豬場普遍流行，其病原菌為胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)[1]。該病原血清型眾多，目前報道的有20多種，而且不同血清型之間缺乏交叉保護性，這也是豬傳染性胸膜肺炎難防難控的最主要原因[2]。生長豬感染APP后出現生長發育緩慢、飼料利用率低，育肥豬出現急性死亡、口鼻流血等癥狀[3]。目前，該病在世界范圍內廣泛流行，嚴重威脅規?；B豬業的發展，給各國養豬業造成巨大的經濟損失[4]。四環素類抗生素是獸醫臨床常用的一類抗生素，應用抗生素治療該病能挽回部分經濟損失，但不能根治[5]。康復后的豬往往成為帶菌者，持續排毒，成為傳染源，嚴重威脅其他健康豬。經抗生素治療后常引起細菌耐藥性增強，導致多重耐藥或者超級耐藥，給臨床治療帶來極大挑戰[6]。

四環素、土霉素等四環素類抗生素是臨床常用的抗生素，這類抗生素具有共同多環并四苯羧基酰胺母核衍生物[7]。四環素類抗生素易導致細菌產生耐藥性，并且具有交叉耐藥性。這類抗生素的殺菌機制是引起細菌細胞膜的通透和抑制蛋白質的合成。四環素類抗生素耐藥決定因子TetM、TetO、OtrA、TetS、TetT、TetQ、TetB(P)、TetW、Tet(32)和Tet(36)與核糖體相互作用保護細菌自身免受四環素作用的蛋白質。這些耐藥決定因子位于細菌質粒和轉座子上[8]。目前，國內外有關APP對四環素類抗生素耐藥基因的研究報道較少，APP四環素類耐藥現狀和耐藥流行分子特征也不清楚。本研究就分離鑒定的胸膜肺炎放線桿菌對四環素類抗生素的耐藥基因進行了系統研究，為今后豬傳染性胸膜肺炎的防制和新藥研發提供基礎，為臨床用藥和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養基及試劑

腦心浸液肉湯(含有蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、甘油、脂肪酸、10%馬血清和100 μg/mL NAD)、Buffer、Taq酶等購于Sigma生物技術有限公司。

1.2 APP菌株及其復蘇

2013—2019年臨床分離鑒定的85株胸膜肺炎放線桿菌菌株，-80 ℃保存。將分離鑒定的85株APP接種于腦心浸液肉湯(添加10%馬血清和100 μg/mL NAD)，置于37 ℃的CO2(5%～10%)培養箱中培養24 h，挑取菌落進行下一步試驗。

1.3 APP菌株藥物敏感試驗

采用圓紙片擴散法檢測APP對四環素類藥物的敏感性，包括：四環素、土霉素、金霉素、多西環素、美他環素、米諾霉素和替加環素，根據抑菌環直徑判定藥物的敏感度[9]。

1.4 APP核酸提取

將每株細菌接種腦心浸液肉湯(含有蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、甘油、脂肪酸、10%馬血清和100 μg/mL NAD)，置于37 ℃的CO2(5%～10%)培養箱中培養24 h，收集細菌，提取DNA。

1.5 耐藥基因的PCR檢測

設計了10對特異性較高的引物(表1)，分別檢測tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL1和tetL2共10種耐藥基因[10]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 耐藥基因引物及擴增片段大小

PCR反應體系為22 μL：0.22 mmol/L dNTPs 5 μL，0.04 U/μLTaq酶1 μL，10.5 μmol/L引物5 μL，1.5 mmol/L Mg2+2 μL，水9 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性2.5 min；95 ℃變性50 s，55 ℃退火32 s，72 ℃延伸3.2 min，33個循環；最后72 ℃延伸 4.2 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后進行回收和測序。

2 結果與分析

2.1 藥敏試驗

APP對各藥物的耐藥率分別為：四環素76.5%(65/85)，土霉素28.2%(24/85)，金霉素54.1%(46/85)，多西環素45.9%(39/85)，美他環素48.2%(41/85)，米諾霉素25.9%(22/85)，替加環素22.3%(19/85)。

2.2 APP耐藥基因的PCR檢測

采用PCR方法對四環素類抗生素耐藥基因(tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL1、tetL2)進行檢測，結果顯示，tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL2、tetL1耐藥基因的耐藥率分別為78.8%(67/85)、41.2%(35/85)、15.3%(13/85)、8.2%(7/85)、21.2%(18/85)、15.3%(13/85)、43.5%(37/85)、24.7%(21/85)、30.6%(26/85)、tetL1全部陰性，未檢出其耐藥基因。部分檢測結果的電泳圖譜見圖1至圖9。

M. DL2000 DNA Marker; 1～17. 部分樣品圖1 部分樣品耐藥基因檢測結果

3 討論

四環素類抗生素是廣譜抗菌藥物，是獸醫臨床常用的一類抗生素類預防或者治療性藥物，在規?；B豬生產中被廣泛應用，長期應用或者不合理應用，常常造成細菌耐藥，出現多重耐藥菌株或者超級耐藥菌株[11]。四環素類藥物的抗藥性普遍存在于細菌中，其耐藥的主要機制是抑制蛋白質的合成和誘導活性外排系統[12]。APP血清型眾多，根據報道目前有20多個，各血清型之間既無交叉反應，又無交叉免疫力。市場上現有疫苗菌株大多是單個血清型或者雙重血清型，預防效果有限，這就給豬傳染性胸膜肺炎的防控帶來了極大挑戰。

APP是豬細菌病中最重要的一種病原菌，世界范圍內均有分布。該菌可導致各種年齡段的豬發病，可引起育肥豬的急性死亡。感染該菌后，病原菌迅速導致豬肺臟纖維素性出血、壞死性胸膜肺炎、胸腔粘連。耐過的豬肺臟中常有壞死骨片，其含有致命性的載量細菌，抗生素類藥物很難穿透這種壞死骨片，成為帶菌傳染源，從而引起該病的暴發。該菌不同菌株的致病力差別較大，高毒力菌株可導致高死亡率[13]。

豬傳染性胸膜肺炎的防控主要依靠嚴格的生物安全措施、衛生防疫制度及疫苗預防接種。市場上的疫苗主要有滅活疫苗和亞單位毒素疫苗[14]。由于本病原的血清型較多，互相之間的交叉免疫能力差，各血清型之間交叉保護性不強。豬感染APP后應及早采取藥物治療，抗生素的選擇需要依據藥物敏感性試驗結果和現場藥物使用情況而定。

本研究結果表明，分離鑒定的85株APP對四環素類藥物耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tet1、tetL2的耐藥率分別為78.8%、41.2%、15.3%、8.2%、21.2%、15.3%、43.5%、24.7%、30.6%，tetL1全部陰性，未檢出其他耐藥基因。APP對四環素的耐藥率最高為76.5%，其他依次為金霉素、美他環素、多西環素、土霉素、米諾霉素和替加環素，藥敏試驗結果與耐藥基因基本一致。本研究就APP對四環素類抗生素的耐藥性及耐藥基因進行了系統的研究，為抗生素的應用和新藥研發及臨床應用提供了基礎。