NaCl 脅迫下外源尿囊素對菊花葉綠素熒光特性及活性氧清除酶系統的影響

劉真真,梁明珠,段利萍,劉 洋,鄭成淑,孫憲芝,王文莉

山東農業大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室,山東 泰安271018

菊花(Chrysanthemum morifoliumRamat.)是菊科菊屬多年生宿根花卉，是我國的十大傳統名花之一，也是世界四大切花之一。菊花具有極高的觀賞和經濟價值，在花卉生產應用中占有非常重要的地位。目前我國的切花菊生產，主要是在設施大棚內進行。由于設施內一般采用大水澆灌且次數頻繁、蒸騰量大，土壤中鹽分無法及時隨雨水流走或淋溶到土壤深層，而是殘留在了土壤耕層，使土壤中含鹽量累加，嚴重影響切花菊的生產和品質。

尿囊素（allantoin，C4H6O3N4），簡稱All，廣泛存在于動植物體內。在高等植物中嘌呤降解是All 合成的主要途徑。首先腺嘌呤核苷酸（adenosine monophosphate，AMP）與鳥嘌呤核苷酸（guanosine monophosphate，GMP）在細胞質基質中經過脫氨等作用生成尿酸[1]。尿酸在尿酸氧化酶（urate oxidase，UOX）作用下生成5-羥基異尿酸鹽，然后在尿囊素合酶（allantoin synthase，AS）作用下生成All。這個過程在過氧化物酶體中進行[2]。在酰脲滲透酶（ureide permease，UPS）和其他轉運蛋白（allantoine transporter）的作用下，植物合成的All 進入細胞質參與發揮作用[3]，或者分泌到細胞間質，參與氮素轉運[4]。植物細胞中的內質網是是All 分解代謝的主要場所[5]。All 經過尿囊素酶（allantoinase）和尿羥乙酸裂解酶（ureidoglycolate lyase）作用下最終轉化成乙醛酸（glyoxylate）并生成尿素，或者是在尿囊素酶和尿羥乙酸水解酶（ureidoglycolate hydrolase）的作用下轉化成乙醛酸、NH3和CO2[6]。

在高等植物中，All 不僅是氮素轉運和存儲過程中的重要物質，參與植物體內氮素轉運、存儲以及再利用等活動，而且在植物抗逆方面有重要作用。近年來研究表明，植物在營養缺乏[7]、高輻照度[8]、高鹽[9]以及干旱[10]等脅迫條件下，均伴有All 的積累。同時，體內較高的All 水平或者外施All又可誘導植物體的一系列脅迫應答反應[11]。對擬南芥尿囊素酶功能缺失突變體（aln）的研究發現，aln 植株中尿囊素的大量累積自發地啟動ABA 合成，進而誘導植物體內抗逆應答相關基因的表達，提高了擬南芥突變體幼苗對非生物脅迫的耐受性。此外，野生型擬南芥外施尿囊素后，表現出與aln植株相似的抗逆性提高表型[12]。由此可見尿囊素在植物體抗逆應答中起著非常重要的作用。Brychkova 等[13]研究表明，外源施加尿囊素降低了黑暗脅迫下擬南芥H2O2含量并且增加了葉片中的葉綠素含量。目前外源尿囊素對提高植物抗逆性的研究不多，在緩解菊花鹽脅迫方面的研究未見報道。為此，本試驗以切花菊‘神馬’為試材，研究不同濃度的外源All 對NaCl 脅迫下菊花幼苗的生物量、葉綠素熒光、活性氧含量和抗氧化酶的影響，以期探討All 在緩解鹽脅迫方面的作用和機制，篩選最佳緩解菊花NaCl 脅迫的尿囊素濃度，為合理利用外源All 解決菊花設施栽培中的鹽害問題和培育抗鹽菊花品種提供科學依據。

1 材料與方法

試驗于2017 年3 月～2018 年10 月在山東農業大學園藝試驗站和園藝學院中心實驗室進行。

1.1 試驗材料

供試菊花品種‘神馬’（Chrysanthemum morifolium‘Jinba’）插穗取自山東農業大學園藝試驗站溫室中生長健壯的母株。扦插苗生根后定植于盛有栽培基質（園土:草炭:蛭石=2:1:1）的塑料盆中（1盆1 株），一個月后，挑選生長一致、長勢良好的植株，進行試驗處理。NaCl 濃度從40 mmol·L-1、70 mmol·L-1、100 mmol·L-1逐步增加到140 mmol·L-1，鹽適應共28 d。于第29 d 開始測定葉綠素熒光參數，每兩天測定一次，測定10 d，共測6 次。試驗共設7 個處理，每處理10 盆，3 個重復。處理1（CK）：葉片噴水，根部澆不含NaCl 營養液；處理2（T0）：葉片噴水，根部澆140 mmol·L-1NaCl（營養液從塑料盆下部滲漏為止）；處理3（T1）：140 mmol·L-1NaCl+1 mmol·L-1All；處理4（T2）：140 mmol·L-1NaCl+2 mmol·L-1All；處理5（T3）：NaCl+3 mmol·L-1All；處理6（T4）：140 mmol·L-1NaCl+4 mmol·L-1All；處理7（T5）：140 mmol·L-1NaCl+5 mmol·L-1All。每隔一天噴施一次All，均勻噴灑在葉片的正、反面，以不滴液為度，對照噴蒸餾水，共5 次。于噴施All 處理后0、2、4、6、8 和10 d測定葉綠素熒光參數；于噴施All 處理10 d 時對植株進行生長量的測定，并取植株自頂部往下第4～5片完全展開的功能葉，測定其他各項生理指標。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 葉綠素熒光參數 每次測定時間在上午10：00～11：00，每個處理隨機選3 盆，采用英國Hansatech公司生產的FMS-2 型脈沖調制式熒光儀，測定植株頂部向下第4 片完全展開功能葉的葉綠素熒光參數。測定前將葉片暗適應15 min，以弱檢測光測定初始熒光（Fo），之后以飽和脈沖光測定最大熒光（Fm）。當熒光從Fm回落至接近Fo時，以連續的作用光測定穩態熒光（Fs）。之后疊加一個飽和脈沖光，測定光下最大熒光（Fm'）。最后關閉作用光，并立即打開遠紅光，測定光下最小熒光（Fo'）。可變熒光（Fv）按Fm-Fo計算，PSII 的最大光化學效率按Fv/Fm計算，PSII 的量子產額（ΦPSII）按（Fm'-Fs）/Fm'計算，光化學猝滅系數（qP）按（Fm'-Fs）/（Fm'-Fo'）計算，非光化學猝滅系數（qN）按1-（Fm'-Fo'）/（Fm-Fo）。

1.2.2 其他生理指標測 過氧化氫(H2O2)含量測定參照碘化鉀法；超氧陰離子(O2·-)生成速率采用羥胺氧化法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）法；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚法[14]；利用UV-245 紫外分光光度計（日本Shimadzu 公司）測定吸光光度值，各指標數據測定重復3 次。

1.3 數據處理

采用Excel 2007 軟件對數據進行處理和作圖，利用SPSS 22.0 軟件進行相關性分析和方差分析，并運用Duncan 檢驗法對顯著性差異進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 NaCl 脅迫下外源尿囊素對菊花葉綠素熒光參數的影響

圖1 NaCl 脅迫下外源尿囊素對菊花葉綠素熒光參數的影響Fig.1 Effects of exogenous allantoin on chlorophyll fluorescence parameters of chrysanthemum under NaCl stress

由圖1（A～F）可以看出，NaCl 脅迫下菊花的Fo和qN上升，Fv/Fm、ΦPSII、qP和ETR下降，不同濃度的All 均可以提高脅迫植株的ΦPSII和Fv/Fm值，其中外源噴施3 mmol·L-1All（T3）的植株Fv/Fm值顯著高于NaCl 脅迫的植株，第10 d 時Fv/Fm值為0.422，是NaCl 脅迫植株的1.73 倍，說明外源噴施3 mmol·L-1All 可以提高菊花NaCl 脅迫下的光能轉換效率，緩解NaCl 脅迫對菊花光系統的傷害。

NaCl 脅迫造成了菊花植株qP的持續下降，但噴施外源不同濃度的All 后，菊花植株的qP始終高于NaCl 脅迫的植株，處理第10 d 時，分別提高了43.40%、62.01%、63.45%、37.82%和47.55%，其中3 mmol·L-1All 較于對照（CK）降幅最小，為0.644。除了1 mmol·L-1和2 mmol·L-1濃度的All外，3～5 mmol·L-1濃度的All 處理均減緩了鹽脅迫植株qN的上升，處理第10 d 時分別較NaCl 脅迫的植株降低了10.87%、22.31%和32.29%。

由圖1（F）可見，NaCl 脅迫引起光合電子傳遞速率（ETR）顯著下降，而外源噴施All 后，不同濃度All 均可以使菊花植株的ETR上升，其中3 mmol·L-1All 處理植株的ETR和對照接近。說明All 可以有效提高NaCl 脅迫下菊花植株的相對電子傳遞效率。

2.2 不同濃度外源尿囊素對NaCl 脅迫下菊花株高和干重的影響

如表1 所示，噴施All 處理10 d 時，菊花株高和地上部干重及根系干重均有不同。NaCl 脅迫下（T0）的菊花株高與CK 相比顯著降低了9.96%（P＜0.05），2～4 mmol·L-1的外源All 顯著增加了植株的株高，在3 mmol·L-1All 處理下（T3），菊花植株株高較NaCl 脅迫下未噴施All 處理的（T0）增加最多，提高了3.85%，1 mmol·L-1和5 mmol·L-1的All 處理的植株株高有所增加，但增幅不顯著。NaCl 脅迫下，菊花地上部干重和根系干重與對照（CK）相比均顯著下降（P＜0.05），分別降低了12.59%和22.33%，外源噴施All 后，不同濃度處理的菊花植株地上部干重均有不同程度地升高，其中，3 mmol·L-1All 處理下，菊花地上部干重較NaCl 脅迫提高了8.21%，達到顯著性差異（P＜0.05），與沒有NaCl 脅迫的植株（CK）株高差異不顯著；噴施All 后根系干重較單純NaCl 脅迫處理的植株變化差異不顯著。

表1 不同濃度外源All 對NaCl 脅迫下菊花株高和干重的影響Table1 Effects of exogenous allantoin on plant height and dry weight of chrysanthemum under NaCl stress

2.3 NaCl 脅迫下外源尿囊素對菊花O2·—、H2O2、SOD 和POD 的影響

噴施外源All 處理10d 對NaCl 脅迫下菊花O2·-、H2O2、SOD 和POD 的影響見圖2。

圖2 NaCl 脅迫下外源尿囊素對菊花O2·-（A）、H2O2（B）、SOD（C）和POD（D）的影響Fig.2 Effects of exogenous allantoin on O2·-（A）、H2O2（B）、SOD（C）and POD（D）in chrysanthemum under NaCl stress

從圖2（A、B）可知，NaCl 脅迫下菊花葉片中O2·-產生速率顯著上升、H2O2含量顯著增加。3、4、5 mmol·L-1濃度的外源All 處理均顯著降低了菊花O2·-產生速率（P＜0.05），以3 mmol·L-1處理的降幅最大。3 mmol·L-1和4 mmol·L-1的外源All 處理可以顯著降低菊花葉片中H2O2的含量（P＜0.05）。如圖2（C）所示，NaCl 脅迫下，SOD 活性與對照相比沒有顯著差異，噴施不同濃度的的外源All均顯著增強了菊花植株的SOD 活性。All 濃度為3 mmol·L-1時，菊花葉片中H2O2的含量以及O2·-產生速率最低，較NaCl 脅迫處理（T0）分別降低了21.90%和27.92%，且SOD 的活性最強，是NaCl脅迫處理的2.30 倍。而處理植株（T0～T5）的POD 活性均顯著高于對照（CK），除5 mmol·L-1All 處理外，其余濃度All 處理均顯著低于NaCl 脅迫時未用All 處理植株（T0）。

3 討論

葉綠素熒光參數可以有效反映植物受逆境脅迫后光合系統的受損程度[15]。在本研究中，隨著NaCl 脅迫時間的延長，菊花的Fo表現出持續上升，Fv/Fm、ΦPSII實際光化學效率（ΦPSII）和ETR持續下降，說明NaCl 脅迫對PSII 反應中心產生了抑制，植株葉片同化CO2的能力下降，對葉綠體中的ATP 和NADPH 的需求量降低，造成光能過剩[16]。NaCl 脅迫下噴施外源All 后，菊花ΦPSII值和ETR上升，且菊花葉片的Fv/Fm值始終高于NaCl 脅迫的植株，說明All 可能降低了葉綠體中活性氧含量，增強了光合系統的活性，因此PSII 開放的反應中心比例和參與CO2固定的電子有所增加，光合電子傳遞能力提高，同時光合色素捕獲和轉化光能的效率增加，葉片暗反應的受阻情況有所緩解。隨著NaCl 脅迫時間的延長，菊花植株的qP下降、qN持續上升，脅迫對光合機構產生了光抑制，植株通過熱耗散消耗植株中過剩的光能，緩解PSII 的損傷程度。而噴施3～5 mmol·L-1的All 后qP上升，表明天線色素吸收的光能用于光合作用的份額增加，光合機構活性增強；qN下降，表明植株內以熱能耗散的光能數量減少，用以進行光合作用的能量增加。

在NaCl 脅迫下，高濃度的活性氧能引起DNA、蛋白質和脂質過氧化，破壞膜結構。在正常生理狀態下，抗氧化酶系統可使活性氧的產生和消除維持在一種動態平衡狀態。本研究中，在NaCl脅迫下外源噴施All 后顯著降低了植株葉片中的O2·-產生速率和H2O2，這與Nourimand M[17]的研究結果一致，All 可能作為一種活性氧清除劑發揮作用，減輕了因ROS 增多對細胞質膜產生的破環。逆境脅迫下導致植物活性氧水平增加的同時，植物體內的SOD 和POD 作為最重要的抗氧化酶也被激發，主要作用是清除富余活性氧，維持自由基生成與消除的動態平衡[18]。本研究中，NaCl 脅迫下菊花葉片中SOD 活性與對照沒有明顯差異而POD 活性增加，可能是由于處理第10 d 細胞內的活性氧含量已經超出了SOD 的清除范圍，SOD 酶系統較POD 更早地受到破壞。外源噴施All 后SOD 活性顯著增強而POD 活性降低，推測外施All 后，脯氨酸等物質的增加穩定了酶結構，提高了SOD的活性。SOD 將植物體內多余的O2·-轉化為H2O2，導致H2O2大量累積。理論上來說，POD 會將H2O2轉化成為對植物細胞無害的氧氣和水，從本研究結果看，1～4 mmol·L-1All 處理植株的POD 活性均顯著低于NaCl 脅迫植株（T0），POD 活性下降而H2O2含量也有所降低，可能是All 作為一種活性氧清除劑參與了H2O2的清除而替代了POD 的作用，有待進一步研究。

植株生物量積累與植物耐鹽性密切相關，生長量的變化可以綜合反映出植物對NaCl 脅迫的響應[19]。本研究中，NaCl 脅迫下菊花的株高、地上部分的干物質累積量和根系的干物質積累量均顯著下降，說明NaCl 脅迫對菊花植株生長具有明顯的抑制作用，植株的株高、地上部分和地下部分變化程度有所不同，可能是逆境條件下植物通過調整不同部位生物量的累積來應對外界不利環境條件，有研究表明，在NaCl 脅迫下，植物主要是由于不同生長部位對鹽分敏感性的差異而進行生物量分配模式的調整[20]。本研究結果表明，在一定濃度范圍內，NaCl 脅迫下施加外源尿囊素（All）處理后菊花的株高、地上部分干物質積累均有明顯提高，說明All 可以緩解鹽脅迫對植物生長的抑制。而地下部分生物量沒有較顯著的改善，可能由于監測時間短根系結構影響變化不大。

綜上所述，在NaCl 脅迫下外源噴施All 可以緩解脅迫對菊花植株PSII 活性的抑制，提高SOD活性并可能作為活性氧清除劑清除細胞內多余的O2·-和H2O2以提高植株對NaCl 脅迫的抗性，從而對NaCl 脅迫下菊花植株生長抑制起到緩解作用，且以3 mmol·L-1的All 處理效果最好。